论文部分内容阅读
羰基还原酶(EC 1.1.1.184)具有高度化学、区域和立体选择性,是目前最具潜力的制备手性化合物的生物催化剂之一。来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(S)-羰基还原酶II可以将2-羟基苯乙酮不对称转化为(S)-苯基乙二醇。对该酶底物催化区域实施定点突变,其突变酶E228S能高效催化苯乙酮转化为(R)-苯乙醇。本研究利用基因工程技术,使(S)-羰基还原酶II和突变体E228S,及其二者与葡萄糖脱氢酶(GDH)分别偶联后,在酿酒酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae osw2△)异源表达并包埋于孢子中,获得了性能优良的微胶囊酶,能高效转化(S)-苯基乙二醇和(R)-苯乙醇。具体研究内容包括:(1)构建了重组酵母菌株S.cerevisiae osw2△/p RS424-TEFpr-scr II、S.cerevisiae osw2△/p RS424-TEFpr-E228S、S.cerevisiae osw2△/p RS424-TEFpr-scr II-SD-AS-gdh、S.cerevisiae osw2△/p RS424-TEFpr-E228S-SD-AS-gdh。以醋酸钾为唯一能源物质诱导培养重组酵母产生孢子,将重组蛋白包埋其中,形成SCRII、E228S、SCRII-GDH和E228S-GDH的微胶囊酶。利用免疫蛋白印迹技术检测了4种目标蛋白均存在于微胶囊体系中。同时构建目的酶与绿色荧光蛋白融合的重组酵母菌,借助激光共聚焦技术进一步证实了目标蛋白成功包埋于孢子微胶囊中。(2)以四种微胶囊酶为生物催化剂进行不对称转化,SCRII微胶囊酶催化6 g?L-1底物2-羟基苯乙酮4 h,产物(S)-苯基乙二醇光学纯度和产率分别为99.3%和99.0%;E228S微胶囊酶催化6 g?L-1底物苯乙酮5 h,产物(R)-苯乙醇的光学纯度和产率分别为99.1%和95.1%;SCRII-GDH微胶囊酶催化20 g?L-1底物2-羟基苯乙酮3 h,产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为99.7%和92.1%;E228S-GDH微胶囊酶催化20 g?L-1底物苯乙酮4.5 h,产物(R)-苯乙醇的光学纯度和产率分别为99.8%和89.7%。另外,4种微胶囊酶均具有较好的耐热性和宽广的p H作用范围。(3)考察了SCRII-GDH和E228S-GDH微胶囊酶的多批次使用性能、有机溶剂耐受性、储存稳定性。在反复使用10次后,SCRII-GDH微胶囊酶催化20 g?L-1底物2-羟基苯乙酮产率仍高于63%,E228S-GDH微胶囊酶催化20 g?L-1底物苯乙酮产率仍维持在55%,产物的光学纯度维持在99%以上;两种微胶囊酶均能耐受多种15%的醇、酯、烷烃类有机溶剂,并且在15%强极性溶剂DMSO存在时SCRII-GDH微胶囊酶催化转化产物的产率高达85.4%;两种微胶囊酶经30oC风干24 h后用于生物转化,产物的产率仍能达到50%左右,而在–20oC冷冻储存长达70天并且反复冻融10次后,两种微胶囊酶催化产物的产率相比未冷冻处理的微胶囊酶低5%左右,产物的光学纯度不变。(4)在辅酶偶联再生的体系(SCRII-GDH和E228S-GDH)中,胶囊酶孢子在添加葡萄糖进行辅酶再生时,有可能会导致酵母孢子萌发。通过在每次反应中添加放线菌酮抑制酵母孢子萌发。并结合显微观察分析子囊孢子作为新型酶固定化载体包埋目标蛋白后的形态学变化,确定了微胶囊酶孢子在不对称转化反应中停留在休眠体状态。