论文部分内容阅读
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性病毒（porcineepidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种以仔猪腹泻、呕吐、脱水为主要临床症状的传染病。PEDV属于尼多病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronavirus），是有囊膜的正链RNA病毒。PEDV基因组为28kb，含有6个开放性阅读框（ORFs），其中ORF2编码的纤突蛋白（S蛋白）为PEDV的结构蛋白之一，对于PED的诊断及防治具有重要意义。本研究根据GenBank公布的PEDV基因组全序列，针对S蛋白中的可诱导强中和反应的S1-1抗原表位基因设计特异性引物对其进行克隆、不同表达载体原核表达，并且利用重组蛋白（His-S1-1）免疫BALB/c小鼠研制单克隆抗体。另外，通过对酿酒酵母真核表达质粒pYD1-S1-1的改造，使诱导表达成本大大降低。1. PEDV S1-1基因克隆及原核表达根据GenBank已发表的PEDV基因组全序列设计1对表达引物，通过RT-PCR扩增出PEDV S1-1蛋白的420bp基因片段，命名为S1-1，克隆至PGEX-4T-1、pET-32a（+），用IPTG诱导，SDS-PAGE电泳结果表明：两种重组表达菌都能高效表达，融合蛋白均主要以包涵体形式存在，两种重组蛋白分子量分别为32KDa和40KDa。His-S1-1蛋白最佳诱导条件：37℃条件下，活化重组菌1.5h后加入IPTG（浓度为0.6mmol/L），诱导4h融合蛋白表达量最高；GST-S1-1蛋白最佳诱导条件：37℃条件下，加入IPTG（浓度为0.4mmol/L），诱导5h融合蛋白表达量最高。经过MagneGST和HisTrapTMFF蛋白纯化试剂盒对两种融合蛋白的纯化分离，最终获得浓度约1.1mg/mL的GST-S1-1纯化融合蛋白和2.6mg/mL的His-S1-1纯化融合蛋白。经间接ELISA方法检测，表明两种纯化融合蛋白反应原性良好。2. S1-1蛋白单克隆抗体的制备取纯化的融合His-S1-1蛋白免疫BALB/C小鼠4次，待第4次免疫后断尾采血，通过间接ELISA检测免疫小鼠抗体效价，以His-S1-1纯化蛋白作为检测抗原时，免疫小鼠最高抗体效价为1:5.12×10~5；以GST为检测抗原时，免疫小鼠最高抗体效价为1:1.28×10~5。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。GST-S1-1纯化融合蛋白作为间接ELISA检测抗原，通过有限稀释法进行亚克隆，最终获得1株稳定分泌抗S1-1抗体的阳性杂交瘤细胞株。纯化腹水间接ELISA效价为1:2.56×10~6，通过Western-blot分析表明：该株单抗均能与PEDV S1-1蛋白发生特异性反应。3.酿酒酵母穿梭质粒pYD1-S1-1质粒的改造根据GenBank已发表的3-磷酸甘油脱氢酶启动子基因序列设计1对特异性引物，引物两端带有左右同源臂基因序列，本研究从酿酒酵母基因组中通过PCR扩增出3-磷酸甘油脱氢酶启动子（GPD1）的713bp目的基因片段，通过同源重组技术，将原载体上半乳糖弱启动子成功替换为3-磷酸甘油脱氢酶强启动子。