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水稻细菌性基腐病是由Dickeyazeae(异名为菊欧文氏杆菌玉米致病变种Erwinia chrysanthemi pv.zeae)引起的一种重要植物病害,在我国及东南亚国家许多稻区严重发生,造成严重减产,带来巨大经济损失。由D.zeae所致的水稻细菌性基腐病近年来引起了国内外科学家的高度关注,目前对其的研究主要集中在细菌学和生物学特征,然而,对其寄主特性和致病机制的了解还相当少。
本研究利用D.zeae菌株EC1构建了Tn5插入突变体库,筛选出5个胞外蛋白酶减少或缺失的突变体,利用hiTAIL-PCR方法获得突变基因的全序列,通过酶活生物测定和接种试验分析突变体的表型、致病性,进行基因互补试验验证突变基因的功能,为进一步研究水稻细菌性基腐病菌胞外蛋白酶致病机理及其调控机理奠定理论基础。结果如下:
1.Tn5转座子随机插入的方法构建EC1突变体库,经过蛋白酶水解圈法从7500株突变体中筛选到5株突变体,分别命名为Em72、Em94、Em274、Em1196、Em1217-2。另外,Em152和Era1217-2为无效突变体,在本文中作为对照。
2.通过hiTAIL-PCR方法获得7株突变体中突变目的基因全长。其中,Em72和Em274突变在相同的基因中,该基因全长1434 bp,编码477个氨基酸,Blastp比对结果与Dickeyazeae Ech1591的蛋白酶Serralysin有63％的同源性;EC1Serralysin基因被Tn5突变后蛋白酶减少,对水稻种子萌发的抑制能力降低,同时对马铃薯和大白菜的致病力也降低了。RT-PCR分析表明,Tn5插入突变的Serralysin基因不表达。基因功能互补结果证实了Serralysin与D.zeae菌株EC1的致病性密切相关。Em1196突变在一个长为927 bp的基因中,编码308个氨基酸,Blastp比对结果与Dickeyazeae Ech1591的假定蛋白Dd1959_1508有96%的同源性;Em1217-2突变在一个长为1230bp的基因中,编码409个氨基酸,Blastp比对结果与Dickeyazeae Ech1591的major facilitator superfamily MFS_1有88%的同源性。这两突变不仅影响蛋白酶产生,还影响其他表型,失去抑制水稻种子萌发的能力,同时对马铃薯和大白菜的致病力也大大降低。