论文部分内容阅读
目的:脂肪源性间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）由于来源丰富、取材简单、免疫原性和成肿瘤性低,是再生医学和组织工程研究中干细胞疗法的重要种子细胞,但其在高糖环境或者体外扩增过程中容易出现衰老及增殖能力下降,严重影响ADSCs的治疗效果,限制了ADSCs细胞治疗在糖尿病患者中的应用。有研究发现,大鼠和人的ADSCs均表达瞬时受体电位香草酸亚型1（Transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1）,但其生理学功能尚未阐明。因此,本研究旨在观察TRPV1配体辣椒素对二维（Two dimensional culture,2D）和三维（Three dimensional culture,3D）培养下ADSCs增殖的影响以及对高糖诱导的ADSCs衰老是否有保护作用,由此改良体外培养方法为临床获得足够数量且高质量的ADSCs提供保障。方法:（1）原代培养大鼠脂肪干细胞,流式细胞术对ADSCs进行免疫表型（阳性指标CD29、CD90和阴性指标CD31、CD45）鉴定后,取3～5代进行实验,分别采用2D培养和3D培养模式,后者采用琼脂糖微孔板法培养3D细胞球,观察不同浓度辣椒素（1μM,3μM,10μM）对两种维度培养下ADSCs增殖的影响。2D培养的增殖指标采用CCK-8检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期,Western blot检测增殖细胞核抗原PCNA的蛋白水平。3D培养下ADSCs的增殖采用Celltiter-Glo 3D Cell Viability Assay检测细胞活力。采用Western blot检测2D和3D状态下的细胞多能转录因子Nanog、Oct4、Sox2的水平,确定ADSCs的干性。Western blot检测细胞周期抑制蛋白P21的表达以及ERK的磷酸化水平,给予MAPK/ERK信号通路阻断剂PD98059确定该通路对ADSCs增殖的作用。慢病毒转染sh RNA敲低TRPV1表达进一步探究TRPV1对ADSCs增殖的影响。（2）取第3～5代的ADSCs,用高糖（33 m M葡萄糖）培养基孵育ADSCs 4天,建立高糖诱导的干细胞衰老损伤模型,给予不同浓度的辣椒素（1μM,3μM,10μM）处理细胞,通过CCK-8检测细胞活力,β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞,流式细胞术检测细胞周期阻滞、活性氧（ROS）水平及细胞凋亡,Western blot检测SIRT1和P21,Elisa检测炎症因子IL-6水平,确定辣椒素对高糖诱导的ADSCs衰老的影响。TRPV1-sh RNA慢病毒转染细胞,进一步确定沉默TRPV1后是否影响辣椒素抗ADSCs衰老作用。结果:（1）辣椒素显著促进2D培养的ADSCs增殖,表现为显著增加细胞活力,上调增殖细胞核抗原PCNA的蛋白水平,其中3μM辣椒素的作用最为显著,并增加细胞周期中S期和G2/M期的比例。（2）与2D培养相比,3D培养下ADSCs细胞球的多能干性指标Nanog、Oct4、Sox2表达水平更高,但3D培养状态下的细胞增殖能力远低于2D。3μM辣椒素促进3D培养的ADSCs增殖,Celltiter-Glo 3D Cell Viability Assay结果确定辣椒素水平显著增加3D状态下细胞活力,且Western blot结果显示辣椒素并不会降低3D状态下ADSCs中Nanog、Oct4、Sox2干性基因表达。（3）Western blot结果显示,辣椒素剂量依赖性增加ERK的磷酸化水平,并显著下调细胞周期抑制蛋白P21的表达。而预先给予MAPK/ERK信号通路阻断剂PD98059,不仅取消辣椒素的促增殖作用,还降低细胞活力。（4）Western blot和q PCR结果确定TRPV1-sh RNA显著下调TRPV1的表达,而TRPV1敲减抑制PCNA水平,降低2D和3D培养状态下的细胞活力,并取消了辣椒素的促增殖效应。进一步研究发现,3μM辣椒素可上调TRPV1的表达水平。（5）辣椒素显著抑制高糖诱导的ADSCs衰老,表现为减少高糖诱导的细胞衰老数目,解除G1/G0期抑制,降低高糖诱导的ROS生成,并降低IL-6水平。Western blot结果显示,辣椒素可上调长寿蛋白SIRT1表达,下调衰老蛋白P21表达,而SIRT1抑制剂EX527取消了辣椒素的抑制ADSCs衰老效应。此外,流式检测还证实辣椒素可降低高糖诱导的细胞凋亡率。（6）β-半乳糖苷酶染色和CCK-8结果显示,TRPV1-sh RNA可增加高糖状态下的细胞衰老,并且取消辣椒素抑制衰老的效应。结论:（1）辣椒素对2D和3D培养的ADSCs均有显著促增殖效应,其机制可能与激活MAPK/ERK信号通路,下调细胞周期抑制蛋白P21水平有关。（2）辣椒素可抑制高糖诱导的ADSCs衰老和凋亡,其机制可能与上调长寿蛋白SIRT1的表达,下调细胞衰老相关蛋白P21的表达,减少高糖诱导的ROS和IL-6生成有关。