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背景:过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-acti vated receptor,PPAR)是一种具有目的基因表达调节作用的核内受体转录因子,依据结构的不同,PPAR可分为α、β(或δ)和γ三种类型,其中PPARγ主要在脂肪组织及免疫系统表达,参与脂肪细胞分化、机体免疫调节,并且与胰岛素抵抗密切相关。目前研究表明在2型糖尿病中,PPARγ与胰岛素抗性相关,胰岛素增敏剂药物噻唑烷二酮(trog litazone,TZDs)是PPARγ的有效激动剂,可通过PPARγ调节细胞对胰岛素的敏感性,促进糖代谢。但由于个体化的差异,20%~30%的2型糖尿病病患者对TZD无反应,且TZDs存在明显副作用,如水钠潴留导致心力衰竭、骨折等风险。目的:在PPARγ相关通路中寻找新的胰岛素增敏靶点,以解决单一药物靶点个体化差异,并为进一步阐明胰岛素抵抗机制,本论文构建了人PPARγ慢病毒过表达载体,为后续研究PPARγ的功能作用奠定基础。方法:1.根据人类cDNA文库中PPARγ的基因序列设计引物,以质粒p GEM-PPARγ为模板,PCR扩增目的基因human PPARγ;2.在引物两端分别引入NheI和NotI的酶切位点,再对载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro以及目的基因Human PPARγ的NheI和NotI双酶切;3.将质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro回收大片段与human PPARγ片段的连接;4.对连接产物转化,将转化产物抽提质粒,用NheI+NotI进行酶切鉴定,挑取酶切鉴定正确的阳性克隆进行测序验证。5.将含有目的基因的重组质粒导入293T细胞,产生高滴度含目的基因的慢病毒,即LV-hPPARγ-GFP-Puro慢病毒,简称为LV-hPPARγ。结果:成功构建了含有目的基因的慢病毒表达载体pCDH-CMV-hPPARγ-EF1-CoGFP-T2A-Puro;成功进行了慢病段包装,LV-hPPARγ慢病毒滴度为1×10~8TU/ml。