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胃癌的死亡率一直居高不下,其5年生存率徘徊在20%～30%；其中,胃印戒细胞型胃癌,因其生物学行为复杂、异质性强、治疗反应率低,成为肿瘤相关死亡的主要原因之一。肿瘤干细胞因其多向分化能力和自我更新能力,被认为是肿瘤异质性、治疗反应率低和复发的根源,而靶向肿瘤干细胞治疗被认为能够从根源上治疗肿瘤,防止复发。本研究将着重阐明胃癌细胞系中是否存在明显差异的干细胞亚群,并建立一个理想的富含干细胞的胃癌细胞系模型和有明显异质性的干细胞亚群模型,在此模型基础上探讨个体化治疗并初步探讨干细胞的调控机制,筛选重要的调控因子,达到靶向干细胞治疗的目的。第一部分：为了深入了解胃印戒细胞癌的生物学行为并筛选个体化治疗的药物,我们建立了病人来源的肿瘤移植模型(patient-derived tumor tissue,PDTT)及同一病人来源的胃印戒细胞癌的细胞系,命名为GCSR1。多种生物学行为特征鉴定结果显示GCSR1核分裂多见,核边聚,呈现印戒细胞样形态。细胞周期时相S期细胞比例、瓶壁和软琼脂集落形率分别为25%、24.13%和10%,呈现较强的体外生存能力。GCSR1细胞系经连续传至80代左右,细胞形态、生长曲线和倍增时间、细胞周期、集落形成能力等性状仍保持相对稳定。干细胞表型研究发现,GCSR1高表达干细胞表面标记蛋白CD44和CD133,并且有很强的体内成瘤能力,提示GCSR1富含胃癌干细胞。综上所述,我们建立了一株稳定的富含肿瘤干细胞的胃印戒细胞癌细胞系GCSR1。第二部分：为了筛选指导临床治疗的有效化疗药物,我们结合细胞系GCSR1和PDTT模型对4种一线化疗药物进行了筛选。结果提示：GCSR1细胞系多药耐受,仅对化疗药物表阿霉素(EPI)敏感。结合第一二部分结果：我们发现GCSR1富含干细胞且多药耐受。第三部分：为了明确GCSR1细胞系中干细胞和耐药的关系,并排除异质性对后续研究的干扰,我们通过有限稀释法从GCSR1细胞系中分离培养9个细胞亚群。通过流式细胞术和微球形成两种方法筛选干细胞特性差异明显的细胞亚群,结果表明其中一个细胞亚群GCSR1-6高表达表面标记CD133,微球形成能力明显,具有明显的干细胞表型；同时还存在一株干细胞特性较弱的细胞亚群,被命名为GCSR1-11。同时还发现GCSR1-6与GCSR1-11相较,运动能力更强,生长更缓慢,恶性程度更高。最重要的是GCSR1-6出现明显的5-FU耐受,而GCSR1-11对5-FU敏感,结果提示我们GCSR1-6是GCSR1对5-FU耐受的主要细胞群。综上所述,GCSR1-6是一株恶性程度非常高的具有明显干细胞特性的细胞亚群,是GCSR1细胞系耐药的主要细胞亚群,与GCSR1-11细胞亚群相比,异质性非常明显。因而靶向治疗GCSR1-6细胞亚群可能可以达到克服耐药,提高治疗效果的目的。为了达到这个目的,我们初步探讨了GCSR1-6细胞亚群调控的机制,结果发现：转录因子P-catenin在GCSR1-6细胞核内高表达,下调β-catenin表达后,GCSR1-6细胞形态发生改变,凋亡增加,干细胞标记CD44下调。结果提示,β-catenin是参与干细胞调控的重要蛋白。第四部分：为了进一步阐述GCSR1-6和GCSR1-11细胞亚群的基因表达异质性并深入研究干细胞调控的分子机制,我们进行了RNA-seq转录组测序研究,初步分析的结果提示,按照P<0.05, log2(Fold change)绝对值>1的标准,共有328个基因在GCSR1-6和GCSR1-11中差异表达。其中153个基因在GCSR1-6中高表达,175个基因在GCSR1-6中低表达。将差异基因输入KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路研究网站发现,共187条信号通路参与调控。这些差异基因和信号通路,为后续的基础临床验证打下基础。