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耐青霉烯类药物的肠杆菌科（CRE）曾被称为“超级细菌”,是发生医院内感染与社区获得性感染的常见病原体,感染后死亡率高达72%,并呈上升趋势。早期特异性诊断,合理抗菌药物治疗是临床治愈该类感染性疾病的关键环节。然而,尽管目前病原体及其耐药型鉴定方法很多,但大多基于免疫学与分子生物学原理,需要昂贵的医疗设备,耗费时间较长,灵敏度不高,还存在操作者职业暴露等瓶颈问题。基于此,本研究以阴沟肠杆菌及其耐碳青霉烯类药物基因（bla KPC、bla NDM、bla IMP、bla VIM、bla OXA48家族）为例,建立环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测技术,并与传统PCR和药敏试验进行对照研究,筛选并鉴定基因;同时应用进化树分析承德地区临床样本同源性,确认耐药基因的相应进化情况,指导感染源确认,抗菌药物的选择和临床疗效评估。由于该技术便携性和可操作性较强,灵敏度较高,可以推广应用于所在现场或基层医疗机构。实验内容分2部分完成。第一部分改良的环介导等温扩增技术在阴沟肠杆菌DNA与16Sr RNA中的应用目的:建立一种改良的环介导等温扩增（LAMP）技术标准反应体系,完成阴沟肠杆菌DNA与16Sr RNA快速检测,并应用于临床感染样本的检测。方法:1.培养标准菌株并建立LAMP体系以阴沟肠杆菌ATCC13047标准菌株为研究对象,设计针对该菌株的特异性引物,提取该细菌的DNA和16Sr RNA,分别建立LAMP扩增反应体系,优化反应体系各种成分和反应条件,经过倍比稀释进行灵敏度检测;通过以本实验室保存的副乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等5种其他细菌进行特异性验证,并与经典的PCR检测技术进行一致性检验。2.应用LAMP技术检测临床标本应用上述检测体系和反应条件,对41例临床样本进行检测,并根据临床常用的细菌培养和鉴定的检测结果,进行对照研究,进一步验证该方法的检测效率。结果:1.在LAMP体系优化过程中,发现MgSO4和甜菜碱的终浓度分别为4 m M和0.2 m M时扩增效果最好,且在反应前向体系中加入终浓度为0.05m M的钙黄绿素和0.6 m M的Mn Cl2,当反应结束后,可以经肉眼直接通过颜色变化,对扩增结果进行直接判定。2.在特异性实验中未出现非特异性扩增,特异性较好;在敏感度实验中以DNA为模板建立的LAMP显示对阴沟肠杆菌ATCC13047标准菌株的检测极限为1 IU/ML,比PCR法高出一个数量级;以16Sr RNA为模板建立的LAMP显示对阴沟肠杆菌ATCC13047标准菌株的检测极限为10-1 IU/ML,比PCR法高出两个数量级。3.以DNA为模板,建立的LAMP技术,应用在41例患者标本中,其敏感度和特异性分别为92.68%,100%;以16Sr RNA为模板建立的LAMP技术,应用在患者临床标本中,其敏感度和特异性分别为95.12%,100%;同期相同标本经PCR检测,其灵敏度和特异性分别为为90.24%,100%。与PCR技术的检测结果比较,前者建立的LAMP检测法的结果无统计学差异（Kappa=0.799）,后者建立的LAMP检测法的结果也无统计学差异（Kappa=0.827）,且二者一致性均较好（P＞0.05）。结论:1.成功建立了以阴沟肠杆菌DNA为模板的快速LAMP检测技术,且DNA模板获取方式为煮沸法,操作简便、快速,减少微生物暴露,且该技术灵敏度高,特异性强,与传统PCR检测一致性比较好,更适合现场和基层医院对感染性疾病的病原学诊断。2.利用16SrRNA仅存在于活菌中,且呈多拷贝特性,成功建立了以阴沟肠杆菌16Sr RNA为模板的快速LAMP检测反应体系和检测技术,能够更好的明确诊断且可以用于临床疗效的判定,但与直接以DNA为模板进行LAMP扩增比较,存在操作过程略复杂等缺陷。第二部分阴沟肠杆菌碳青霉烯类药物耐药基因的筛选、LAMP快速检测技术的建立与进化树分析目的:应用改良的环介导等温扩增（LAMP）可视化检测耐碳青霉烯类药物的阴沟肠杆菌的耐药基因（bla KPC、bla NDM、bla IMP、bla VIM、bla OXA48家族）,以期快速确认患者感染的阴沟肠杆菌耐药情况,选择敏感抗生素,给予规范、合理的治疗。方法:1.收集标本并建立LAMP体系1)根据第一部分收集的承德医学院附属医院确诊为阴沟肠杆菌感染的患者标本41例,并收集同期确诊耐碳青霉烯酶的阴沟肠杆菌标本5例,进行碳青霉烯酶表型筛选实验与PCR测序最终确定三例CRE,分别为bla KPC型、bla NDM型与bla IMP型,作为阳性菌株用于LAMP体系建立。2)应用直接煮沸法提取标本DNA后置于-20℃保存备用。3)查阅文献,登录NCBI网站,Primer-Blast验证引物特异性,选择最佳引物,通过终浓度梯度试验对LAMP体系进行优化。4)通过模板互换实验证实这5套引物的特异性,通过检测梯度稀释后的DNA分析其灵敏度,在LAMP反应前加入钙黄绿素使结果可视化,将显色结果与电泳图对比以验证可视化结果的准确性。结果:1.通过优化实验建立了扩增效率更高的LAMP体系,经优化后特异性较好,未出现非特异性扩增情况,对耐药基因bla KPC、bla NDM、bla IMP、bla VIM、bla OXA48家族的检测极限分别为10、10、102、1、1 IU/ML,其中五种耐药基因建立的改良LAMP的检测极限均比普通PCR高一个数量级;加入钙黄绿素后的可视化结果与电泳结果相当,可以通过肉眼对扩增结果进行直接判定。2.通过三种碳青霉烯酶表型筛选试验从41例阴沟肠杆菌标本中共同筛选出7例B类耐碳青霉烯酶的阴沟肠杆菌,其中4例为bla NDM型,2例为bla IMP型,1例为bla NDM与bla IMP的混合型。经过PCR测序,构建进化树分析得知4、35、38标本之间同源性较高;5,26,29标本之间同源性较高;36标本与其他菌株距离较远,同源性较低。结论:1.LAMP具有较好的特异性,对耐药基因bla KPC、bla NDM、bla IMP、bla VIM、bla OXA48家族的检测极限均比普通PCR高一个数量级,相比普通PCR法灵敏度更好。2.LAMP技术可检测粗提的CRE,且检测结果可视化,颜色变化鲜明,操作过程更加简单,更适合条件简陋的基层或现场检测。3.通过构建系统发育树,通过测序判断标本同源性,验证了耐药基因的筛选的正确性,根据结果指导临床用药。