卵巢具有胚胎发育、组织解剖以及内分泌功能等较为复杂的特性,且置于盆腔深部,导致卵巢癌早期的局部乃至全身症状均极少出现,发病具有隐蔽性。由于卵巢癌在早期往往缺乏明显的临床相关症状,因此大约70%的患者被确诊时已处于疾病的晚期阶段,多伴有腹膜转移或恶性腹水等。目前临床上治疗卵巢癌的主要策略为最大程度上的肿瘤细胞减灭术,术后给予紫杉醇联合铂类药物化疗的综合治疗。顺铂及它的同类物卡铂在临床上作为一线化疗药已被广泛用于卵巢癌的治疗中。但多数患者经综合治疗后约2年内会复发并出现铂类耐药现象,致使晚期卵巢癌患者的5年生存率仍徘徊在30%左右^[1]。顺铂本质为无机金属-铂的络合物,其药物活性与氯离子的浓度呈负相关。当其进入人体低氯的细胞内后活性增高,很快会发生水合解离,生成了带正电荷的水合配离子。在DNA静电引力的作用下,水合配离子便向着细胞核迁移,最终形成加合物并改变DNA的正常复制,导致肿瘤细胞DNA复制障碍,从而抑制肿瘤细胞的分裂^[2]。顺铂的药物浓度决定其抗肿瘤活性,即短时间内每次给药浓度越高,其抗肿瘤疗效就越好^[3]。由于顺铂本身对人的耳、肾、消化道等多种器官有毒性,限制了它的大剂量使用,从而影响对肿瘤细胞的最大杀伤作用。另外,由于卵巢癌患者复发和治疗时间的延长,产生对铂类耐药也限制了其临床使用。目前在卵巢癌的治疗中多采取联合用药和改变给药途径等方法来达到减毒增效的目的^[3]。随着对卵巢癌发生发展相关分子生物学机制的深入研究,卵巢癌新的治疗靶点不断被发现,其中尤以血管靶向治疗较突出。贝伐单抗是一种重组人源化的单克隆抗体,它的作用机制是通过抑制VEGF与其受体结合,进而中和了VEGF的生物学活性,阻断VEGF下游多条信号通路的正常传导,破坏并抑制为癌细胞提供营养的新生血管的形成,减缓肿瘤的生长并且抑制了肿瘤的远处转移,来达到治疗目的^[4]。另外,贝伐单抗还能够使肿瘤的血管正常化,有助于化疗药物进入瘤体内部,从而发挥更有效的抗肿瘤作用。贝伐单抗联合卡培他滨和顺铂的使用已被批准用于晚期胃癌的临床治疗。研究显示,化疗药物联合贝伐单抗较化疗药物单独使用时明显增加了患者的无进展生存期^[5]。贝伐单抗联合顺铂在临床上治疗非小细胞肺癌恶性胸腔积液时效果显著高于顺铂单独使用组。此外还发现在晚期恶性黑色素瘤患者中给予贝伐单抗与顺铂的联合使用所表现的近期疗效也优于顺铂的单独使用。本文旨在研究VEGF靶向药物贝伐单抗与临床常用化疗药物顺铂的联合使用对卵巢癌细胞SKOV3的作用机制,为临床卵巢癌的治疗提供了一定的理论依据。目的检测正常、良性、恶性卵巢上皮组织中VEGF、MMP-9蛋白的表达情况,分析二者在卵巢癌组织中表达的相关性,并重点探讨贝伐单抗联合顺铂对SKOV3的作用机制。研究对象和实验方法1.研究对象:收集上皮性卵巢恶性肿瘤患者41例（卵巢癌组）,术前未接受放化疗;卵巢良性肿瘤患者30例（卵巢良性肿瘤组）;因良性宫体病变行卵巢切除的患者30例（正常对照组）。所有上述患者均经病理学确诊,卵巢癌组、卵巢良性肿瘤组与正常对照组在年龄方面差异无统计学意义（P>0.05）。2.研究方法:对上述101例卵巢上皮组织采用免疫组化检测卵巢组织中VEGF、MMP-9蛋白的表达情况;MTT实验检测贝伐单抗及贝伐单抗联合顺铂对SKOV3的体外增殖抑制作用;Transwell实验检测贝伐单抗、顺铂单独及联合使用对SKOV3侵袭的影响;Annexin V-FITC和PI双染法结合流式细胞术检测贝伐单抗、顺铂单独及联合使用时对SKOV3凋亡的影响;Western blot实验检测贝伐单抗联合顺铂对VEGF下游信号通路中关键蛋白、MMP-9蛋白及Bad蛋白表达的影响。3.统计学方法:采用SPSS19.0进行统计分析。卵巢癌组、卵巢良性肿瘤组、正常对照组中VEGF、MMP-9蛋白表达阳性率采用多样本率的χ²检验,免疫组化评分采用Kruskal-Wallis H非参数检验;卵巢癌组织中VEGF、MMP-9蛋白表达的相关性采用Pearson相关分析;贝伐单抗单独及联合顺铂使用对SKOV3侵袭及凋亡的影响采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。结果1.3组卵巢组织中VEGF、MMP-9蛋白的表达水平。免疫组化检测结果显示:对组织中VEGF、MMP9蛋白表达阳性数和免疫组化评分的统计分析得出:VEGF、MMP-9在卵巢癌组织中处于高表达（P<0.001,vs正常对照组和卵巢良性肿瘤组）,经Pearson相关分析结果显示χ²=6.034,r=0.360,P=0.014,即VEGF、MMP-9在卵巢癌组中呈正相关。2.贝伐单抗及贝伐单抗联合顺铂在体外对SKOV3的增殖抑制作用。在体外分别采用不同浓度（2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L）的贝伐单抗处理SKOV3,结果显示SKOV3增殖抑制作用与贝伐单抗呈剂量依赖性,其IC50值为（8.89±0.27）mg/L。贝伐单抗与3 mg/L的顺铂联合使用对SKOV3增殖抑制作用更强。3.贝伐单抗、顺铂单独及联合使用对SKOV3侵袭的影响。由Transwell图看出贝伐单抗和顺铂单独药物处理组与对照组相比发生的侵袭细胞数较少,在联合药物处理组发生的侵袭细胞数明显减少,经过单因素方差分析结果显示联合药物处理组与单独药物处理组相比差异具有统计学意义（P<0.001）4.贝伐单抗、顺铂单独及联合使用对SKOV3凋亡的影响。贝伐单抗单独处理组细胞凋亡率为（6.8±0.8）%,顺铂单独处理组凋亡率为（13.1±2.1）%,而联合使用凋亡率则增加到（38.0±2.2）%,经过单因素方差分析结果显示,联合药物处理组细胞凋亡率明显大于单独药物处理组,且差异具有统计学意义。5.贝伐单抗、顺铂单独及联合使用对VEGF下游信号通路中的关键蛋白、MMP-9蛋白和Bad蛋白表达的影响。顺铂单独使用时对VEGF下游信号通路中关键蛋白AKT的磷酸化水平无明显影响,贝伐单抗的单独使用可减弱AKT磷酸化的表达,但二者联合可显著减弱磷酸化AKT的表达水平,并且其下游信号通路中促凋亡蛋白Bad的表达显著增强。贝伐单抗、顺铂的单独使用对MMP-9蛋白的表达影响不大,而二者联合以后,可显著减弱MMP-9蛋白的表达水平。结论1.在卵巢癌组织中VEGF、MMP-9蛋白呈现共同过表达状态,在卵巢癌的发生发展中起促进作用。2.贝伐单抗联合顺铂抑制SKOV3细胞增殖、减弱侵袭、诱导凋亡。3.贝伐单抗联合顺铂抑制VEGF下游信号通路的传导,从而发挥协同抗肿瘤效应,为临床治疗卵巢癌提供一定的理论依据。