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在所有的真核、原核生物中,胸腺嘧啶核苷酸合成酶(thymidylate synthase,TS)是一磷酸脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)合成途径的一个关键酶。dTMP是一磷酸脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP)的甲基化产物,在dTMP的合成过程,TS催化dUMP甲基化生成dTMP。5,10-二甲基四氢叶酸是这个反应的甲基供体,它还是甲基反应的电子供体,由此可见TS是DNA合成和修复必要的酶。RNA干扰(RNA interfering,RNAi)是一种从低等生物到哺乳动物的保守的防御反应。双链RNA在细胞内被RNA酶Ⅲ(RNaseⅢ)酶切成约21-23nt的小片段干扰RNA(siRNA),进而形成siRNA-蛋白复合物,即RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC通过识别降解具有同源序列的信使RNA(messenger ribonucleicacid,mRNA),最终导致特异性的基因表达沉默。本研究通过自行构建能在大鼠卡氏肺孢子(pneumocystis carinii,PC)内转录出功能性siRNA的载体,并将其用于干扰TS基因的表达,为下一步基因功能和治疗手段的研究奠定基础。本研究共分为两个部分。一、大鼠卡氏肺孢子TS基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定方法:人工合成针对PC TS基因的1对shRNA序列并定向克隆到siRNA(small interference RNA)真核表达载体pTZU6+1上,采用双酶切和测序法鉴定;结果:酶切和测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致;结论:成功构建卡氏肺孢子胸腺嘧啶核苷酸合酶靶向shRNA的真核表达载体。二、RNAi抑制大鼠卡氏肺孢子TS基因的体外实验研究方法:连续地塞米松腹股沟皮下注射Wistar大鼠6周诱导建立卡氏肺孢子肺炎动物模型;体外提取并纯化PC,将含有GFP的pTZU6+1质粒与Lipofectamine 2000分别按质量与体积比2∶2、2∶4、2∶6、2∶8转染至PC中,并分别在转染后24h、48h、72h在荧光显微镜下计数表达荧光的滋养体的数量;将质粒转染PC,在转染24h、48h、72h分别计数每视野包囊均数,转染48小时后通过RT-PCR测定TS基因mRNA水平的表达;并在转染后48h取标本作扫描电镜,观察重组质粒转染组和对照组PC超微结构的变化。结果:连续地塞米松皮下注射大鼠可诱导建立卡氏肺孢子肺炎动物模型;转染48小时后绿色荧光蛋白表达数量最多;转染48小时后重组质粒每视野包囊均数最少,且与空白组和空质粒组有明显差异;shRNA真核表达载体能有效抑制PC TS基因表达,与转染空载体组和空白组比较,TS基因mRNA表达减少至45.07%;转染48小时后PC表面出现损害主要为表面微绒毛脱落,残存微绒毛水肿呈球型,有的PC包囊表面损害严重,出现大小不等的孔洞。结论:Lipofecttamine2000对重组质粒有较强的转染效率;shRNA真核表达载体能有效抑制TS基因mRNA表达,并且对PC超微结构产生一定程度的破坏。