目的:喉癌是全世界范围内最常见也是致死率最高的头颈部肿瘤之一。流行病学资料显示,喉癌在男性中高发,发病人群的年龄多在40岁以上,且90%以上的喉癌其临床病理学分型为喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LS CC)。尽管喉癌在早期诊断与治疗手段方面取得了诸多进步,但喉癌患者的五年生存率变化不大,其中很重要的原因在于喉癌的早期症状不明显,缺乏可靠的早期诊断生物学标记物。由于手术治疗效果不尽如人意,喉癌患者大都会死于复发和转移。基于目前喉癌的发病机制尚不清楚,因此探讨喉癌细胞的发生、发展和侵袭的机制具有重要的临床意义。研究表明,基质金属蛋白酶家族(matrix mettal loproteinases,MMPs)通过参与细胞外基质的降解过程而影响恶性肿瘤细胞的侵袭和转移。膜性基质金属蛋白酶(membrane type-1 matrix metalloproteinase,MT1-MMP)属于MMPs中的一个重要成员,在喉癌发生、发展过程中可能发挥着重要的作用。因此本研究主要目的是了解MMP-14在LSCC组织中的表达及其临床意义,进一步探讨MMP-14蛋白的表达与LSCC的发生、发展和预后之间的关系。本研究将有助于发现喉癌早期诊治、判定预后的新生物学标志物,并为喉癌的早期诊断、随访监测和靶向治疗提供科学理论依据。方法:本研究选择40例行全喉或部分喉切除术的LSCC的患者作为研究对象,收集所有患者的喉癌组织及癌旁黏膜组织标本,组织标本的收集和使用经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准并获得患者的知情同意。使用自制摘录表从患者病历中摘取患者的基本信息、临床资料、癌组织病理类型、患者就诊和治疗经过以及术后完整的生存情况等资料。使用免疫组织化学染色法观测LSCC的癌组织及癌旁黏膜组织中MMP-14蛋白表达变化;应用qRT-PCR法测定LSCC的癌组织和癌旁黏膜组织中MMP-14 mRNA表达变化;应用Western blotting法测定喉鳞状细胞癌组织和癌旁黏膜组织中MMP-14蛋白水平的变化。通过Microsoft Office Excel 2007建立数据库并录入病历采集数据和实验室数据,使用IBM SPS S Statistics 19.0软件对数据进行统计分析。采用两独立样本的t检验或者两独立样本的秩和检验分析两组MMP-14基因表达水平分布的差异,采用卡方连续性矫正公式和Fisher确切概率法分析两组资料MMP-14蛋白阳性表达率之间的差异。采用叉生分析法进一步探讨性分析两组临床资料或者病理资料对MMP-14蛋白阳性表达率的交互作用。使用Kplan-meier分析MMP-14蛋白表达水平对LSCC术后生存率的预测作用,使用Log Rank检验MMP-14蛋白强阳性表达、阳性表达、阴性表达之间累计生存率的差异,同时使用COX比例风险模型估算MMP-14蛋白不同表达水平的相对死亡风险的大小。结果:研究结果发现,40例配对喉癌标本中,有30例MMP-14在喉癌组织中的表达明显高于其相应的正常癌旁黏膜组织,4例喉癌组织中MMP-14的表达较癌旁黏膜组织低,6例喉癌组织中的表达与癌旁黏膜组织表达差异性不明显。MMP-l4基因的表达在不同年龄组、吸烟组、饮酒组、临床分型组、治疗方式组之间的无显著性差异(P>0.05),但在不同临床分期、不同病理分化程度及有无淋巴结转移的喉癌中表达差异性具有统计学意义(P<0.05),临床分期为Ⅰ+Ⅱ的喉癌组织中MMP-14基因的表达弱于分期为Ⅲ+Ⅳ的喉癌组织MMP-14的表达(Z=2.153,P=0.031);中低分化喉癌组织中MMP-14基因的表达明显高于高分化的喉癌组织(Z=4.364,P<0.001),在有淋巴结转移的喉癌组织中MMP-14的表达高于无淋巴结转移者(Z=3.544,P<0.001)。MMP-14蛋白在绝大多数喉癌组织中的表达明显高于其相邻的正常黏膜组织,MP-l4蛋白表达与MMP-l4基因表达具有一致性。MMP-14蛋白表达阳性率与临床分期、淋巴结转移、肿瘤分化程度等三项临床病理指标存在显著相关性。临床分期为Ⅲ和Ⅳ期的喉癌患者(OR=5.44,95%CI=1.14-25.95)、肿瘤中、低分化的喉癌患者(OR=9.33,95%CI=1.65-52.92)、有淋巴结转移的喉癌患者(OR=15.55,95%CI=1.73-139.65)MMP-14蛋白表达阳性率的可能性更大。叉生分析结果显示临床分期、淋巴结转移、肿瘤分化程度彼此之间存在显著的交互作用。具体表现为:临床分期与淋巴结转移在MMP-14蛋白表达阳性率中存在显著的交互作用(c~2=8.801,P=0.032),临床分期为Ⅲ和Ⅳ期且有淋巴结转移的患者MMP-14蛋白表达阳性率增大了32(95%CI=2.76-370.81)倍;临床分期与肿瘤分化程度在MMP-14蛋白表达阳性率中也存在显著的交互作用(c~2=9.322,P=0.002),临床分期为Ⅲ和Ⅳ期且肿瘤中低分化的患者MMP-14蛋白表达阳性率增大了24(95%CI=2.21-260.29)倍;淋巴结转移与肿瘤分化程度在MMP-14蛋白表达阳性率中也存在显著的交互作用(c~2=9.322,P=0.002)。值得注意的是,以上交互作用的结果只限于非声门型LSCC患者,而在声门型患者中并没有体现出来。生存分析的结果显示:40例LSCC患者术后平均生存时间为3.84(SE=0.43)年,1、3及5年累计生存率分别为82.50%、55.00%及32.51%。采用Kplan-meier分析的结果显示MMP-14蛋白表达强阳性患者的生存率要显著差于弱阳性组和阴性组,经Log Rank检验,强阳性和弱阳性组(c~2=21.17,P<0.001)、强阳性和阴性组(c~2=20.843,P<0.001)之间累计生存率的差异均有统计学意义;而弱阳性组和阴性组之间累计生存率的差异无统计学意义(c~2=1.468,P=0.226)。采用COX比例风险模型估算MMP-14蛋白表达强阳性相对于阴性患者死亡风险的大小。结果显示,相对于阴性患者,MMP-14蛋白表达强阳性患者死亡的风险相对于阴性患者(HR=13.43,95%CI=4.63-38.94)和弱阳性患者(HR=8.20,95%CI=3.21-20.94)均呈显著性增加。值得注意是弱阳性患者和阴性患者相比,两者的死亡风险并无显著性差异(HR=1.64,95%CI=0.70-3.81)。结论:本研究发现MMP-14蛋白大多数位于LSCC癌巢细胞浆内及癌巢间质内的成纤维细胞浆内,与其相对应的正常黏膜细胞内部分不表达或低表达,MMP-14基因和蛋白在绝大多数喉癌组织中的表达明显高于其相邻的正常粘膜组织。MMP-14基因和蛋白与临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移三项重要临床病理指标均存在显著相关性,且此三项指标在MMP-14蛋白阳性表达中彼此存在显著的交互作用。同时,MMP-14蛋白表达强阳性相对于弱阳性和阴性患者具有较大的死亡风险、预后较差,而弱阳性和阴性患者之间的累计生存率并无差异。本研究的结果具有较大的临床意义,对喉癌早期诊断和预后研判具有科学的指导作用。目的:喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,约占全身恶性肿瘤的5.7%-7.6%,近年来的发病率呈现逐年增加的趋势,由于大部分患者确诊时已达中、晚期,所以喉癌的预后较差。由于目前国内外对喉癌的发病机制尚不清楚,因此探究喉癌发生、发展的分子机制对喉癌患者的早期诊断、预后评估等都具有重要的临床意义。Micro RNAs(miRs)为一大类微小非编码RNA,在生物进程中调节基因的表达发挥着重要作用,临床证据表明miRs作为生物标志物在肿瘤发生发展中发挥重要的生物学作用。本研究通过分析miR-133a和MMP-14蛋白在LSCC中的表达水平,了解miR-133a与MMP-14之间的相互关系,探讨miR-133a靶向调控MMP-14蛋白对喉癌细胞增殖的相关机制,为喉癌的早期诊断和预后评估提供科学的指导意义。方法:本研究选取40例行全喉或部分喉切除术患者的喉鳞状细胞癌组织及癌旁正常粘膜组织标本,以及Hep-2喉癌细胞株为研究对象。通过LipofectamineTM2000 Reagent试剂转染miR-133a mimics和inhibitors进入体外培养Hep-2喉癌细胞株,36~48h后评估各项指标。HE染色法和免疫组织化学染色法观测各组LSCC组织病理改变;q RT-PCR法测定LSCC组织和Hep-2喉癌细胞中miR-133a与M MP-14的mRNA表达情况;Western blotting法测定LSCC织和Hep-2喉癌细胞中MMP-14蛋白表达;MTT法检测miR-133a mimics对Hep-2喉癌细胞活化增殖的影响。结果:研究结果发现,MMP-14基因表达水平在LSCC组织中显著高于癌旁黏膜组织(t=12.19,P<0.001);LSCC细胞浆内及间质内MMP-l4蛋白的阳性表达较明显,MMP-l4蛋白表达的水平与临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移三项重要临床病理指标存在显著相关性,并且和LSCC患者的生存率和死亡率相关,表明MMP-14在喉癌组织中的过度表达可能与LSCC的发生、发展及侵袭和转移存在一定的联系。LSCC组织中miR-133a的表达与癌旁黏膜组织相比显著下降(t=25.68,P<0.001)。Hep-2细胞转染miR-133a模拟物以后,miR-133a在Hep-2细胞中呈现高表达,转染miR-133a模拟物组的miR-133a表达水平显著高于阴性对照组(t=63.83,P<0.001)和空白对照组(t=62.00,P<0.001)。miR-133a的过表达可抑制Hep-2中细胞增殖的活力,转染miR-133a模拟物组的Hep-2中细胞增殖的活力显著低于阴性对照组(t=7.56,P<0.001)和空白对照组(t=8.11,P<0.001)。Mi R-133a的过表达可抑制Hep-2细胞中MMP-14 mRNA和蛋白的表达,具体表现为:1)转染miR-133a模拟物组的Hep-2中MMP-14 mRNA的表达显著低于阴性对照组(t=16.23,P<0.001)和空白对照组(t=14.82,P<0.001),而阴性对照组和空白对照组之间无统计学差异(t=0.21,P=0.833);2)转染miR-133a模拟物组的Hep-2中MMP-14蛋白的表达显著低于阴性对照组(t=19.43,P<0.001)和空白对照组(t=15.20,P<0.001),而阴性对照组和空白对照组之间无统计学差异(t=1.23,P=0.211)。反之,抑制miR-133a的表达可增加Hep-2细胞中MMP-14 mRNA和蛋白的表达水平,具体表现为:1)转染miR-133a抑制物组的Hep-2中MMP-14 mRNA的表达显著高于阴性对照组(t=26.63,P<0.001)和空白对照组(t=25.46,P<0.001),而阴性对照组和空白对照组之间无统计学差异(t=1.32,P=0.189);2)转染miR-133a抑制物组的Hep-2中MMP-14蛋白的表达显著高于阴性对照组(t=41.273,P<0.001)和空白对照组(t=42.85,P<0.001),而阴性对照组和空白对照组之间无统计学差异(t=1.18,P=0.243)。Kplan-meier分析的结果显示:在LSCC组中miR-133a低表达的喉癌患者与miR-133a高表达的喉癌患者相比具有较低的生存率,经Log Rank检验具有统计学意义(c2=14.658,P<0.001)。与miR-133a高表达的LSCC患者相比,低表达者死亡风险呈显著增加(HR=3.949,95%CI=1.815-8.589)。结论:Mi R-133a在LSCC组织中表达水平显著降低,通过靶向负调控MMP-14蛋白的表达水平,引起MMP-14蛋白表达水平大幅度提高,进而影响LSCC细胞的增值和分化,促进癌症细胞的浸润和远处转移。Mi R-133a和MMP-14可作为LSCC预后评价的两个重要生物学标志物,两者联合在LSCC患者的长期预后的预测和评估中具有重要的临床使用价值。