基于功能核酸与等温信号放大技术的新型光学生物传感器研究

来源 :济南大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:sykjzhb
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近年来,随着科技的进步,生物传感器已成为现代生物技术的重要发展方向之一。其中,光学生物传感器因具有选择性好、灵敏度高、操作简单、分析速度快以及价格低廉等优点,被广泛应用于生物、化学、食品、医学和环境等领域。功能核酸探针的发现突破了核酸只是遗传信息存储和转运的载体的传统认识,作为具有高亲和力和特异性等特殊功能的核酸分子,在分析化学领域表现出巨大的优势。等温信号放大技术因其能够在恒定温度条件下实现快速、高效的信号放大,被广泛应用于各种分析物的检测中。功能核酸探针与等温信号放大技术的结合,为生物传感体系的构建提供了一个全新的设计思路和平台。本论文利用功能核酸探针(核酸适配体、分子信标、DNAzyme)的特异性,结合酶辅助的放大技术、无酶联置换和CHA等等温信号放大技术,构建了三种简单、快速、高特异性和超灵敏的新型光学生物传感器。首先,本论文提出了一种基于双功能phi29 DNA聚合酶介导的等温循环联置换放大来检测沙门氏菌的荧光传感策略。该策略依赖于目标触发引起成熟引物的形成,该引物在双功能phi29的辅助下引发循环联置换聚合反应,从而实现目标的放大检测。据我们所知,这项工作是首次将双功能phi29辅助的等温循环联置换放大用于致病菌的荧光检测。值得注意的是,引入了发夹前引物,该引物可通过phi29的3’→5’外切酶校对活性修剪为启动等温循环联置换聚合反应(ICSDP)的成熟引物,这有助于消除不希望的非特异性延伸,从而提高该策略的特异性。基于目前的放大策略,我们的生物传感器对沙门氏菌具有杰出的特异性和灵敏性,检测限低至1.5 cfu·mL-1。并且,该方法具有操作简单、分析时间短、灵敏度高、只需一步反应等优势。此外,通过替换相应的核酸适配体,该策略为致病菌的鉴定和相关的食品安全分析创造了一个强大而方便的荧光传感平台。其次,将邻近连接分析与双向酶修复放大(BERA)相结合,提出了一种新型的超灵敏、高特异性检测三磷酸腺苷(ATP)的荧光传感策略。该策略依赖于邻近绑定触发尾部回文序列的释放,释放的回文序列在聚合酶和两种DNA修复酶的帮助下启动双向循环酶修复放大反应。我们巧妙地设计了一种3’末端含有回文序列的荧光和猝灭基团标记的发夹探针,它不仅可以作为BERA反应的识别元件、引物和聚合模板,而且可以作为荧光信号输出的指示器。基于该放大策略,我们提出的传感器对ATP的检测具有杰出的灵敏性和选择性,检测限为0.81 pM。通过提高目标响应和减少非特异性背景信号,这项工作显示出较高的重现性。此外,我们的生物传感器在实际样品分析中也显示出广阔的应用前景。最后,通过将三通路G-四联体DNAzyme(GQH DNAzyme)与以12个多胞嘧啶为模板的银纳米簇(dC12-AgNCs)巧妙结合,构建了一种无标记、无酶的沙门氏菌超灵敏检测生物传感平台。该方案的原理为,半胱氨酸(Cys)可以与dC12-AgNCs灵敏、快速反应,形成Ag-S键同时增强dC12-AgNCs的荧光。值得一提的是,这是首次将三通路GQH DNAzyme用于沙门氏菌的检测。基于该放大方法,我们所提出的策略对沙门氏菌表现出良好的分析性能,检测限为6.3 cfu·mL-1。此外,该方法操作简单,反应时间短,无需生物分子标记,同时,通过替换相应的适配体,我们提出的策略可以进一步扩展到相关的食品安全分析和临床诊断中。
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