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木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源。木糖是木质纤维素水解产物的主要成分之一,所以有效地利用木糖是生物转化木质纤维素生产乙醇和其它高附加值化学产物的重要基础。本论文以酵母为研究对象,对酵母木糖代谢及其代谢工程进行了深入研究。
通过简便而有效的筛选方法,成功得到Candida guilliermondii Xu280和Candida maltosa Xu316两株天然的木糖醇生产菌株。其中C.maltosa Xu316第一次被报道具有潜在工业利用价值。这些菌株不但木糖利用速度快,木糖醇产率高,而且耐高渗和外界胁迫能力强。
分别克隆了C.guilliermondii Xu280和C.maltosa Xu316的木糖还原酶基因。序列分析表明,醛酮(木糖)还原酶基因序列相当保守,广泛存在酵母各种属中,无论它们能够同化木糖与否。研究重点分析了不同条件致病Candida种的醛酮(木糖)还原酶基因的序列特征。根据各种之间存在着序列的明显差异这一特性,第一次验证了利用酵母醛酮(木糖)还原酶基因序列进化关系分析和菌种鉴定的可行性。
为了深入了解菌株C.maltosa Xu316的木糖代谢调控机制,研究还分离得到其木酮糖激酶基因并进行功能互补试验,同时还分析了木酮糖激酶在木糖醇生产过程中的生理作用。该酶的活性对木糖醇生产是不利的,其表达受到木糖诱导而且和细胞能量状态密切相关。
构建能够高效发酵木糖产生燃料酒精的重组S.cerevisiae酵母是生物转化木质纤维素生产燃料酒精的前提条件。通过构建了一系列具有不同木糖还原酶/木糖醇脱氢酶/木酮糖激酶活性比的重组S.cerevisiae菌株,筛选到菌株EP490具有最大的木糖消耗速率和乙醇生产率。其木糖发酵的各项指标达到或优于国外经常报道的TMB3001菌株,是一株具有良好应用前景的出发菌株。
迄今为止,已知的成功应用转氢酶的事例都是应用其催化NADH生成的反应。本论文试图建立氧化还原辅因子再生循环来解决木糖代谢过程中细胞内氧化还原辅因子不平衡问题。木糖发酵结果显示木糖消耗速率和乙醇产率都明显提高,这些结果表明转氢酶成功地实现了NADH到NADPH的转化。发酵实验证实氧或其它氢受体仍然是重组菌木糖代谢所必需的,异源表达Vitreoscilla sp.HG1的细菌血红素蛋白基因对重组木糖利用S.cerevisiae的乙醇生产率有促进作用。