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第一部分Wilson病热点致病基因突变的选择和基因检测
目的：Wilson病，又称肝豆状核变性，是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病，其致病基因ATP7B以少数几个热点突变为主，伴广泛的散在突变，有明显的地域分布特点。临床观察到该病青岛地区发病率相对较高，拟在我地区进行Wilson病携带者筛查，了解其相对高发的原因。本研究主要目的为：第一，收集我中心Wilson病患者的基因检测结果，了解青岛地区Wilson病基因突变情况，掌握青岛地区Wilson病基因突变的规律和突变热点，并结合文献筛选出该地区常见的突变位点，用于进行青岛地区Wilson病的携带者筛查。第二：根据所选择的突变位点，设计PCR特异性引物，优化反应条件，采用多重PCR结合高通量测序的方法，旨在建立和评估适合我地区特点的热点突变的基因检测和大规模人群筛查的技术路线，初步探讨该方法检测Wilson病基因突变热点的可行性、特异性和敏感性。
方法：收集42例临床已确诊的Wilson病患者，采集外周血，对ATP7B基因的21个外显子编码区进行直接测序，分析基因突变信息，计算各位点的等位基因频率，并结合我国的文献报道，选择青岛地区Wilson病致病基因突变的热点位点。针对所选择的突变位点，利用PrimerZ软件，设计PCR特异性引物。收集Wilson病患者样本5例以及正常样本6例，以上11例样本进行预实验，采用多重PCR结合高通量测序的方法，评估本研究建立的青岛地区Wilson病大规模人群携带者筛查检测方法的准确性和覆盖度。采用离心柱法提取外周血DNA，通过第一步PCR扩增特异性位点、第二步PCR添加生物标签，构建文库。采用磁珠法纯化每步PCR所捕获的DNA产物。完成后，通过琼脂糖凝胶电泳、Qubit浓度检测评估捕获效率。对质检合格的文库混合、稀释、定量，按照标准上机步骤，对富集文库进行序列读取、结果分析。将多重PCR结合高通量测序检测的结果与直接测序的结果进行比较，评估其科学性和准确性。
结果：我中心收集42例Wilson病患者，经直接测序，均检测到ATP7B基因突变，其中纯合突变者5例，复合杂合突变者34例，还有3例患者仅检出一个突变位点。共检测出28个ATP7B基因突变位点，其中明确致病性突变位点25个，多态性位点2个，有争议位点1个，为c.3316G>A(p.V1106I)。检测到1例患者携带母源性c.1366G>C(p.V456L )多态，并携带父源性c.2333G>T(p.R778L )突变伴c.2310C>G(p.L770L)杂合多态。最常见的突变为c.2333G>T(p.R778L)，占42.68%，其次为c.2975C>T(p.P992L)、c.2621C>T(p.A874V)，分别占14.63%、8.54%。既往未见报道的新突变4种，包括：(1 )2种移码突变：c.3767_3768insCA(p.Q1256Hfs )、c.2299dupC(p.M769Hfs*26 )；(2 )1种无义突变：c.1109_1110insACCTG(p.C370X)；(3)1种错义突变：c.2730G>T(p.K910N)。仅检出1个突变c.1543+1G>T位于3号内含子上，其余突变均位于外显子上，检出的突变多位于8、11、13号外显子上，分别占46.34%、13.41%、17.07%，共占76.82%。结合文献报道，筛选出其中12个热点突变进行检测，分别为：c.2333G>T(p.R778L)、c.2621C>T(p.A874V)、c.2975C>T(p.P992L)、c.2804C>T(p.T935M)、c.3443T>C(p.I1148T )、c.3884C>T(p.A1295V )、c.3955C>T(p.R1319X )、c.3809A>G(p.N1270S)、c.2924C>A(p.S975Y)、c.2930C>T(p.T977M)、c.3532A>G(p.T1178A)、c.994G>T(p.E332X)。针对上述位点，设计特异性引物，在基因测序中，经两步PCR反应，捕获浓度为87.2-186ng/μL，均高于60ng/μL，平均捕获浓度160.56ng/μL，捕获效果良好。下机数据分析显示，各样本测序数据量为23.02-32.75Mb，平均29.62Mb。各位点4×覆盖度及20×覆盖度均达到100%。每个样本的平均测序深度为12123.06×-17205.88×，平均14565.32×，测序深度远远大于100×，达到质控标准。5例Wilson病阳性样本中，ATP7B突变位点检测准确，与患者基因检测报告突变信息相符，6例正常样本均未测到ATP7B突变位点，11例样本检测准确，未出现假阳性和假阴性，与直接测序方法比较，其特异性和敏感性均为100%。
结论：1.青岛地区Wilson病ATP7B基因最常见的突变为c.2333G>T(p.R778L)，次常见为c.2975C>T(p.P992L)、c.2621C>T(p.A874V)。发现4种未见报道的新突变。2.青岛地区ATP7B基因仅3个显著的突变热点，等位基因频率共64.29%，其余突变位点散在。本研究选择相对常见的突变位点12个，大约可覆盖45-65%左右的ATP7B基因突变位点。3.本研究根据选择的ATP7B基因突变位点，研发多重PCR结合高通量测序进行相关基因突变的检测方法，该检测方法高效、快捷、准确、结果分析工作量小，成本较低，可用于青岛地区大规模人群Wilson病致病基因携带率筛查。
第二部分青岛地区Wilson病致病基因携带者筛查及分析
目的：Wilson病主要是由于编码ATP7B的基因突变导致铜转运和排泄障碍，过量铜沉积引起的多器官、多系统的损害，是少数几种可以治疗的遗传病之一，但目前尚无有效的筛查途径。国外报道Wilson病在全球的发病率约为1/30000，突变携带者的概率为1/90，近年来多研究表明，发病率可能更高。我国高发，但目前总体发病率未知。临床观察到Wilson病在青岛地区发病率较高，由于该病属于常染色体隐性遗传，本文推测，发病率较高的原因与青岛地区Wilson病致病基因在人群中的携带率高有关。本文旨在通过正常新生儿调查青岛地区Wilson病致病基因热点突变的携带情况，提供青岛地区Wilson病携带情况的首份分子流行病学资料，探讨疾病高发与致病基因携带率的关系，为阐述疾病高发的原因提供遗传学理论依据。此外，Wilson病早诊早治，预后良好。但起病常隐匿，临床表现又极其复杂多样，故临床上常常无法早期确诊，以致延误治疗，致残和致死率均很高。推广携带者筛查不仅可在备孕时或孕前期了解生育风险，有利于遗传咨询与妊娠结局的选择，从而降低发病率，或者是在新生儿期筛查出潜在的患者，从而早期干预，将很大程度上改善预后。此外，本研究拟探讨适合本地区特点的Wilson病携带者筛查方法，提供Wilson病的有效防控措施。
方法：以2016年-2018年在青岛地区进行新生儿筛查的正常新生儿作为研究对象，以直径为13mm的干血滤纸片为筛查标本。磁珠法提取干血滤纸片DNA，采用多重PCR联合高通量测序技术进行基因检测，即通过DNA文库第一步PCR扩增特异性位点、第二步PCR添加生物标签，构建文库。完成后，通过Qubit测定、琼脂凝胶电泳评估捕获效率。对质检合格的文库混合、稀释，然后文库定量，合格后按照标准上机步骤，对富集文库进行序列读取、结果分析。采用SPSS20进行统计学分析，分析检测结果，并统计阳性筛查位点信息。
结果：5012名正常新生儿完成Wilson病致病基因热点突变携带者筛查，ATP7B基因的12个检测突变位点包括：c.2333G>T(p.R778L)、c.2621C>T(p.A874V)、c.2975C>T(p.P992L)、c.2804C>T(p.T935M)、c.3443T>C(p.I1148T)、c.3884C>T(p.A1295V)、c.3955C>T(p.R1319X)、c.3809A>G(p.N1270S)、c.2924C>A(p.S975Y)、c.2930C>T(p.T977M)、c.3532A>G(p.T1178A)、c.994G>T(p.E332X)。携带者筛查检测质控为：测序碱基总数50.33±96.78Mb；已完成质控后的碱基数47.52±92.33Mb；所有样本12个位点均测到，目标区域碱基测序深度大于4×的比例、大于10×的比例、大于20×的比例均为100%。每个样本目标区域的平均测序深度最低为106×，最高为57825×，总体平均测序深度11096.70±7220.92×；针对12个筛查位点，5012例正常新生儿中有73人携带致病基因，其中每人携带1个热点位点突变，未检出携带2个及以上热点位点突变者。73人中检出的突变位点有8个，4个突变位点未检测到有人携带。检出的突变位点为：c.2333G>T、c.2975C>T、c.2621C>T、c.2804C>T、c.3443T>C、c.3532A>G、c.3955C>T、c.2924C>A。ATP7B基因筛查的热点突变位点的携带率为1/68，最常见的突变位点为c.2333G>T，占所有热点位点的54.79%；其次分别为c.2975C>T、c.2621C>T，分别占所有热点位点的17.81%、15.07%。
结论：1.本研究筛查的5012例青岛地区正常新生儿中，针对ATP7B筛查的12个热点突变位点，有73人携带致病基因，热点突变携带率为1/68(1.46%)，由于筛查的仅为45-65%的ATP7B基因突变，推测青岛地区Wilson病总体携带率约为1/34(2.94%)。2.携带致病基因的73人中共检出ATP7B突变位点8个，最常见的突变位点为c.2333G>T，次常见为c.2975C>T、c.2621C>T，与我中心Wilson病患者前3位最常见基因突变位点一致。3.青岛地区ATP7B基因突变携带率高，是导致Wilson病在该地区发病率高的分子生物学基础。4.为制定适合本地区特点的Wilson病的有效防控措施提供理论依据，并建议我地区逐步开展Wilson病的携带者筛查以降低疾病发病率。
目的：Wilson病，又称肝豆状核变性，是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病，其致病基因ATP7B以少数几个热点突变为主，伴广泛的散在突变，有明显的地域分布特点。临床观察到该病青岛地区发病率相对较高，拟在我地区进行Wilson病携带者筛查，了解其相对高发的原因。本研究主要目的为：第一，收集我中心Wilson病患者的基因检测结果，了解青岛地区Wilson病基因突变情况，掌握青岛地区Wilson病基因突变的规律和突变热点，并结合文献筛选出该地区常见的突变位点，用于进行青岛地区Wilson病的携带者筛查。第二：根据所选择的突变位点，设计PCR特异性引物，优化反应条件，采用多重PCR结合高通量测序的方法，旨在建立和评估适合我地区特点的热点突变的基因检测和大规模人群筛查的技术路线，初步探讨该方法检测Wilson病基因突变热点的可行性、特异性和敏感性。
方法：收集42例临床已确诊的Wilson病患者，采集外周血，对ATP7B基因的21个外显子编码区进行直接测序，分析基因突变信息，计算各位点的等位基因频率，并结合我国的文献报道，选择青岛地区Wilson病致病基因突变的热点位点。针对所选择的突变位点，利用PrimerZ软件，设计PCR特异性引物。收集Wilson病患者样本5例以及正常样本6例，以上11例样本进行预实验，采用多重PCR结合高通量测序的方法，评估本研究建立的青岛地区Wilson病大规模人群携带者筛查检测方法的准确性和覆盖度。采用离心柱法提取外周血DNA，通过第一步PCR扩增特异性位点、第二步PCR添加生物标签，构建文库。采用磁珠法纯化每步PCR所捕获的DNA产物。完成后，通过琼脂糖凝胶电泳、Qubit浓度检测评估捕获效率。对质检合格的文库混合、稀释、定量，按照标准上机步骤，对富集文库进行序列读取、结果分析。将多重PCR结合高通量测序检测的结果与直接测序的结果进行比较，评估其科学性和准确性。
结果：我中心收集42例Wilson病患者，经直接测序，均检测到ATP7B基因突变，其中纯合突变者5例，复合杂合突变者34例，还有3例患者仅检出一个突变位点。共检测出28个ATP7B基因突变位点，其中明确致病性突变位点25个，多态性位点2个，有争议位点1个，为c.3316G>A(p.V1106I)。检测到1例患者携带母源性c.1366G>C(p.V456L )多态，并携带父源性c.2333G>T(p.R778L )突变伴c.2310C>G(p.L770L)杂合多态。最常见的突变为c.2333G>T(p.R778L)，占42.68%，其次为c.2975C>T(p.P992L)、c.2621C>T(p.A874V)，分别占14.63%、8.54%。既往未见报道的新突变4种，包括：(1 )2种移码突变：c.3767_3768insCA(p.Q1256Hfs )、c.2299dupC(p.M769Hfs*26 )；(2 )1种无义突变：c.1109_1110insACCTG(p.C370X)；(3)1种错义突变：c.2730G>T(p.K910N)。仅检出1个突变c.1543+1G>T位于3号内含子上，其余突变均位于外显子上，检出的突变多位于8、11、13号外显子上，分别占46.34%、13.41%、17.07%，共占76.82%。结合文献报道，筛选出其中12个热点突变进行检测，分别为：c.2333G>T(p.R778L)、c.2621C>T(p.A874V)、c.2975C>T(p.P992L)、c.2804C>T(p.T935M)、c.3443T>C(p.I1148T )、c.3884C>T(p.A1295V )、c.3955C>T(p.R1319X )、c.3809A>G(p.N1270S)、c.2924C>A(p.S975Y)、c.2930C>T(p.T977M)、c.3532A>G(p.T1178A)、c.994G>T(p.E332X)。针对上述位点，设计特异性引物，在基因测序中，经两步PCR反应，捕获浓度为87.2-186ng/μL，均高于60ng/μL，平均捕获浓度160.56ng/μL，捕获效果良好。下机数据分析显示，各样本测序数据量为23.02-32.75Mb，平均29.62Mb。各位点4×覆盖度及20×覆盖度均达到100%。每个样本的平均测序深度为12123.06×-17205.88×，平均14565.32×，测序深度远远大于100×，达到质控标准。5例Wilson病阳性样本中，ATP7B突变位点检测准确，与患者基因检测报告突变信息相符，6例正常样本均未测到ATP7B突变位点，11例样本检测准确，未出现假阳性和假阴性，与直接测序方法比较，其特异性和敏感性均为100%。
结论：1.青岛地区Wilson病ATP7B基因最常见的突变为c.2333G>T(p.R778L)，次常见为c.2975C>T(p.P992L)、c.2621C>T(p.A874V)。发现4种未见报道的新突变。2.青岛地区ATP7B基因仅3个显著的突变热点，等位基因频率共64.29%，其余突变位点散在。本研究选择相对常见的突变位点12个，大约可覆盖45-65%左右的ATP7B基因突变位点。3.本研究根据选择的ATP7B基因突变位点，研发多重PCR结合高通量测序进行相关基因突变的检测方法，该检测方法高效、快捷、准确、结果分析工作量小，成本较低，可用于青岛地区大规模人群Wilson病致病基因携带率筛查。
第二部分青岛地区Wilson病致病基因携带者筛查及分析
目的：Wilson病主要是由于编码ATP7B的基因突变导致铜转运和排泄障碍，过量铜沉积引起的多器官、多系统的损害，是少数几种可以治疗的遗传病之一，但目前尚无有效的筛查途径。国外报道Wilson病在全球的发病率约为1/30000，突变携带者的概率为1/90，近年来多研究表明，发病率可能更高。我国高发，但目前总体发病率未知。临床观察到Wilson病在青岛地区发病率较高，由于该病属于常染色体隐性遗传，本文推测，发病率较高的原因与青岛地区Wilson病致病基因在人群中的携带率高有关。本文旨在通过正常新生儿调查青岛地区Wilson病致病基因热点突变的携带情况，提供青岛地区Wilson病携带情况的首份分子流行病学资料，探讨疾病高发与致病基因携带率的关系，为阐述疾病高发的原因提供遗传学理论依据。此外，Wilson病早诊早治，预后良好。但起病常隐匿，临床表现又极其复杂多样，故临床上常常无法早期确诊，以致延误治疗，致残和致死率均很高。推广携带者筛查不仅可在备孕时或孕前期了解生育风险，有利于遗传咨询与妊娠结局的选择，从而降低发病率，或者是在新生儿期筛查出潜在的患者，从而早期干预，将很大程度上改善预后。此外，本研究拟探讨适合本地区特点的Wilson病携带者筛查方法，提供Wilson病的有效防控措施。
方法：以2016年-2018年在青岛地区进行新生儿筛查的正常新生儿作为研究对象，以直径为13mm的干血滤纸片为筛查标本。磁珠法提取干血滤纸片DNA，采用多重PCR联合高通量测序技术进行基因检测，即通过DNA文库第一步PCR扩增特异性位点、第二步PCR添加生物标签，构建文库。完成后，通过Qubit测定、琼脂凝胶电泳评估捕获效率。对质检合格的文库混合、稀释，然后文库定量，合格后按照标准上机步骤，对富集文库进行序列读取、结果分析。采用SPSS20进行统计学分析，分析检测结果，并统计阳性筛查位点信息。
结果：5012名正常新生儿完成Wilson病致病基因热点突变携带者筛查，ATP7B基因的12个检测突变位点包括：c.2333G>T(p.R778L)、c.2621C>T(p.A874V)、c.2975C>T(p.P992L)、c.2804C>T(p.T935M)、c.3443T>C(p.I1148T)、c.3884C>T(p.A1295V)、c.3955C>T(p.R1319X)、c.3809A>G(p.N1270S)、c.2924C>A(p.S975Y)、c.2930C>T(p.T977M)、c.3532A>G(p.T1178A)、c.994G>T(p.E332X)。携带者筛查检测质控为：测序碱基总数50.33±96.78Mb；已完成质控后的碱基数47.52±92.33Mb；所有样本12个位点均测到，目标区域碱基测序深度大于4×的比例、大于10×的比例、大于20×的比例均为100%。每个样本目标区域的平均测序深度最低为106×，最高为57825×，总体平均测序深度11096.70±7220.92×；针对12个筛查位点，5012例正常新生儿中有73人携带致病基因，其中每人携带1个热点位点突变，未检出携带2个及以上热点位点突变者。73人中检出的突变位点有8个，4个突变位点未检测到有人携带。检出的突变位点为：c.2333G>T、c.2975C>T、c.2621C>T、c.2804C>T、c.3443T>C、c.3532A>G、c.3955C>T、c.2924C>A。ATP7B基因筛查的热点突变位点的携带率为1/68，最常见的突变位点为c.2333G>T，占所有热点位点的54.79%；其次分别为c.2975C>T、c.2621C>T，分别占所有热点位点的17.81%、15.07%。
结论：1.本研究筛查的5012例青岛地区正常新生儿中，针对ATP7B筛查的12个热点突变位点，有73人携带致病基因，热点突变携带率为1/68(1.46%)，由于筛查的仅为45-65%的ATP7B基因突变，推测青岛地区Wilson病总体携带率约为1/34(2.94%)。2.携带致病基因的73人中共检出ATP7B突变位点8个，最常见的突变位点为c.2333G>T，次常见为c.2975C>T、c.2621C>T，与我中心Wilson病患者前3位最常见基因突变位点一致。3.青岛地区ATP7B基因突变携带率高，是导致Wilson病在该地区发病率高的分子生物学基础。4.为制定适合本地区特点的Wilson病的有效防控措施提供理论依据，并建议我地区逐步开展Wilson病的携带者筛查以降低疾病发病率。