基因编辑技术是基因功能研究中不可或缺的一个技术手段。CRISPR-Cas9技术是一种新型的基因编辑技术，适用于快速建立基因敲除/敲入小鼠、调控基因表达、定点修饰表观遗传状态等。　　然而，对于致死基因来说，通过受精卵一步注射CRISPR-Cas9系统无法获得成年小鼠。为了拓展CRISPR-Cas9的应用，我们提出了一种新型的快速研究致死基因体内功能的方法——2-cell embryo-CRISPR-Cas9(2CC)。该方法包含了两步显微注射:第一步，将Cas9mRNA注射到含有荧光报告基因的小鼠受精卵胚胎中;第二步，将sgRNA和Cre mRNA同时注射到两细胞的其中一个卵裂球中，随后通过胚胎移植，即可获得靶基因敲除且荧光标记的嵌合体小鼠。通过对嵌合体内两种不同荧光标记的野生型和敲除型细胞的表型进行分析，即可实现不同组织中致死基因功能的评估。　　在本论文中，我们首先将Cre mRNA注射到含有荧光报告基因的小鼠两细胞胚胎的一个卵裂球中，获得了各个组织中同时含有两种荧光标记细胞的嵌合体小鼠，验证了小鼠两细胞两个卵裂球的全能性;随后，我们用2CC系统分别对Tet1和Tet3基因进行敲除，皆获得了靶基因敲除的嵌合体小鼠;接着，为了提高基因敲除成功率和简化基因型鉴定过程，我们在2CC系统中利用多个sgRNAs共同注射来实现靶基因的大片段删除;最后，为了展示2CC系统的实用性，我们利用多个sgRNAs介导的2CC系统，对出生致死基因Tet3进行了大片段序列敲除，并用此嵌合体探究了Tet3在小鼠大脑中的功能。研究结果发现，Tet3敲除导致P14小鼠皮层5hmC含量显著下降，伴随着5mC含量轻微上升，提示其介导的主动去甲基化过程受阻。进一步地分析发现，Tet3敲除并不影响小鼠皮层主要类型细胞（神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞）的发育，却严重影响了锥体神经元的兴奋性-抑制性突触传递平衡。从分子层面上来看，Tet3敲除引发了一系列基因表达变化，并在Bdnf和Wfdc2启动子区域去甲基化过程受阻。这些结果表明Tet3在维持神经环路的稳定性中起到了非常重要的作用。　　简单地来讲，本论文成功建立并优化了研究致死基因体内功能的2CC系统，并利用2CC系统探究了Tet3在小鼠大脑皮层发育中的作用。