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川滇地区的道地中药材金龙胆草(Conyza blinii H.Lév)为菊科白酒草属两年生草本植物,具有清热解毒,止咳平喘的功效,是治疗慢性支气管炎的良药。该植物的主要药效成分为一类齐墩果烷型五环三萜皂苷—Conyzasaponins,由于其含量偏低,限制了该中药的开发利用。随着生物技术的不断发展,利用微生物生产次生代谢产物已显出巨大的应用前景。目前国内金龙胆草的研究主要集中在药理药效等方面,有关药效主成分皂苷生物合成途径的研究为空白。本研究利用转录组测序技术建立金龙胆草叶片转录组数据库,从中筛选获得了大量与Conyzasaponins合成相关的基因,包括前体2,3环氧鲨烯合成途径关键酶基因、催化合成三萜皂苷骨架的氧化鲨烯环化酶(OSC)家族基因、调控皂苷结构多样性的细胞色素P450(CYP450)家族基因和糖基转移酶(UGT)家族基因等,初步阐明了Conyzasaponins生物合成代谢流。通过构建酿酒酵母Conyzasaponins合成途径,实现了重要中间产物β香树脂醇、齐墩果酸以及皂苷前体(3-O-Glc-oleanolic acid)在酵母中的合成,为酵母生产Conyzasaponins提供了理论基础和前体材料。具体结果如下:1、以Illumina Solexa Hi Seq 2500测序系统为平台,金龙胆草叶片为材料,获得了42,903,527条Read序列,成功构建了金龙胆草叶片转录组数据库,组装得到了80,930条Unigene序列。其中45.27%在Gen Bank数据库得到了注释,30.33%在Protein family数据库得到了注释,32.36%在Swiss-Prot数据库得到了注释;根据Gene Ontology数据库这些Unigene可分为细胞组分、分子功能以及生物过程3大类52小类,根据eu Karyotic Orthologous Groups数据库可分为信号储存与处理、细胞过程与信号、代谢和无特征4大类25小类。通过Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes数据库搜索,发现这些Unigenes共注释到117条代谢通路上,其中包括与金龙胆草主要活性成分三萜皂苷合成相关的萜类骨干合成通路(ko00900),与金龙胆草特征成分苦蒿素合成相关的二萜类合成通路(ko00904),与金龙胆草黄酮合成相关的黄酮类化合物合成通路(ko00940,ko00941,ko00944)以及与金龙胆草多糖合成相关的聚糖生物合成通路(ko00510,ko00514)等。2、以各数据库注释信息为基础,对金龙胆草皂苷合成途径的基因进行筛选,获得了3条3-羟基-3甲基戊二酸单酰Co A还原酶(HMGR)基因、3条法呢基焦磷酸合酶(FPPS)基因、1条鲨烯合酶(SQS)基因、2条鲨烯环氧酶(SQE)基因、10条氧化鲨烯环化酶(OSCs)基因、26条细胞色素P450单加氧酶(CYP450)基因、7条NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)基因以及47条葡糖基转移酶(UGT)基因;以上序列通过系统进化树筛选,得到了1条HMGR基因、1条FPPS基因、1条SQS基因、1条SQE基因、1条OSC(βAS)基因、2条CYP450基因、1条CPR基因以及8条UGT基因;利用荧光定量检测茉莉酸甲酯处理后基因表达量变化,获得了8条最有可能的基因序列;采用PCR技术克隆得到了Cb HMGR、Cb FPPS、Cb SQS、Cb SQE、CbβAS、Cb CYP716A261、Cb CPR以及Cb UGT73C基因序列,提交Gen Bank数据库,利用生物信息学方法证实它们的基因及蛋白结构特征与同源基因特征相符合。3、利用基因工程手段构建上述8个基因微生物表达载体,实现大肠杆菌或酿酒酵母中的高效表达,通过高效液相色谱(HPLC)、气相色谱质谱联用(GCMS)以及分光光度法验证功能。结果如下:(1)GCMS检测显示Cb HMGR在气相8 min左右产生的特异峰为甲羟戊酸内酯,表明Cb HMGR具有催化HMG-Co A生成甲羟戊酸的功能;(2)通过磷钼蓝比色法检测磷,证明Cb FPPS可对异戊烯基焦磷酸和牻牛儿基焦磷酸作用生成法呢基焦磷酸及中间产物焦磷酸;(3)GCMS检测表明Cb SQS催化反应产物中在11.5 min左右出现的特异峰为角鲨烯,证明Cb SQS可以法呢基焦磷酸为底物生成角鲨烯;(4)通过HPLC检测及2,3环氧鲨烯标准品比对发现Cb SQE具有催化生成2,3环氧鲨烯的功能;(5)通过GCMS检测转入CbβAS基因的酵母发酵产物,发现在19.5 min工程菌和β香树脂醇标准品均产生了特异峰,说明CbβAS具有催化生成β香树脂醇的功能;(6)通过分光光度法检测Cb CPR活性,结果证明Cb CPR可将NADPH的电子传递给氧化型的细胞色素C使其变为还原型而在550 nm产生特征吸收峰;(7)以HPLC检测微粒体蛋白催化反应产物,结果表明Cb CYP716A261在Cb CPR的辅助下可以对β香树脂醇的C28进行修饰生成齐墩果酸;(8)通过HPLC检测Cb UGT73C催化产物在32.8 min产生了一个新的峰,结合上述Cb UGT73C功能预测结果,推测Cb UGT73C可能具有修饰齐墩果酸C3位的作用。4、以酿酒酵母甲羟戊酸途径提供的2,3环氧鲨烯为前体,构建Conyzasaponins在酵母中的生物合成途径。采用重叠延伸PCR将Cb CYP716A261和Cb CPR基因融合,获得一条长为3,573 bp的新基因Cb CPR-linker-Cb CYP716A261。通过同源重组方法将融合基因与CbβAS基因分别构于p ESC-URA表达载体的两个多克隆位点,转入酿酒酵母INVSc1,半乳糖诱导18 h后采用荧光定量检测目的基因表达情况,获得工程菌INVSc1-TM5,诱导60 h后TM5中成功生成了35 mg/L的齐墩果酸;而后将Cb UGT73C构于p ESC-His表达载体转入TM5,通过尿嘧啶和组氨酸双营养缺陷型平板筛选及荧光定量检测,获得工程菌INVSc1-TM6,半乳糖诱导后HPLC检测TM6发酵产物,初步判断成功生成了3-O-Glc-oleanolic acid。以上实验结果揭示Conyzasaponins合成的第一步为CbβAS环化2,3环氧鲨烯形成β香树脂醇,第二步为Cb CYP716A261直接氧化β香树脂醇生成齐墩果酸,最后通过Cb UGT73C等糖基化修饰齐墩果酸生成Conyzasaponins。