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西尼河病毒(West Nile Virus, WNV)属于单链正股RNA病毒其中的黄病毒科黄病毒属,可引起人类及马、鸟类等多种动物发病。WNV有三个结构蛋白：C (Capsid)蛋白、E (Envelope)蛋白和M (Membrane)蛋白。研究表明,在一定条件下同时表达E蛋白和M蛋白的前体prM可以形成病毒样颗粒(VLP)。试验第一部分以西尼罗河病毒NY99株的序列为基础,通过分段合成得到prM和E蛋白的全基因。通过PCR扩增在prm+e基因两侧引入相应的酶切位点及纯化标签,然后将其插入到供体质粒pFast-Bac1中得到重组质粒Pfast-Bac1-W。将测序验证无误的重组质粒转化进入大肠杆菌DH10-Bac。在DH10-Bac中,目的基因借助转座子的协助插入到杆粒中,并破坏空杆粒原有的半乳糖苷酶基因。试验中通过蓝白斑筛选及PCR验证得到重组杆粒。将提取纯化的重组杆粒转染草地贪夜蛾sf9细胞,得到重组杆状病毒。以重组杆状病毒感染正常的sf9细胞,然后收集感染不同时间段的细胞及上层培养基,通过RT-PCR、SDS-PAGE和Western Blot检测目的基因是否转录或表达。将重组质粒Pfast-Bac1-W转化进入大肠杆菌DH10-Bac,筛选得到的白斑经多对引物扩增都与预期的一致,说明重组杆粒构建成功。用重组杆粒转染sf9细胞后得到的一代病毒重新感染细胞可以看到明显的细胞病变。经检测二代病毒液病毒粒子的滴度为7.6×107pfu/mL。将二代病毒液以感染复数(MOI)等于5的比例感染正常的sf9细胞,反转录PCR显示在感染后的第一天目的基因就得到了转录,同时有少量的重组杆状病毒释放到培养基中。SDS-PAGE显示在43.0-66.0kD之间,感染细胞裂解液较正常细胞的裂解液多出一条带。经Western Blot检测,这一差异蛋白能与WNV兔多抗反应,从分子量上判断,该蛋白为WNV的E蛋白。本研究的第二部分通过T载体过渡将prm+e基因插入到两个原核表达载体pET-30a(+). pGEX-4T-1中得到重组质粒pET-30-W,pGEX-4T-1-W。经测序验证正确后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,以IPTG诱导。取不同时间和不同IPTG浓度下诱导的样品以SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白以确认目的蛋白是否表达及最佳的诱导条件。试验结果显示,prM+E蛋白无法在大肠杆菌BL21中得到表达,尝试不同时间诱导和不同浓度的IPTG诱导也没有改善。试验一是国内外首次使用杆状病毒表达系统成功表达出完整的prM+E蛋白,虽然通过Western Blot没有检测到prM/M蛋白,但是由于prm/m基因的读框与e基因一致且位于前端,一旦E蛋白表达,prM/M蛋白必然已经得到表达。prM+E蛋白的存在形式及是否得到分泌还需要进一步研究。通过裂解细胞纯化的E蛋白不仅可以作为检测抗原,还可以用作亚单位疫苗。如果能进一步验证培养基中存在VLP形式的蛋白,则经过浓缩即可以用于MAC-ELISA等检测方法,因此该试验为进一步构建血清学早期诊断方法奠定了基础。