论文部分内容阅读
研究背景和目的:经皮冠状动脉介入治疗(PCI)已成为目前治疗冠心病的重要手段,但无论是经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)还是支架植入术都存在术后冠脉再狭窄(RS)的问题。RS的发生机制尚未完全明确,动物实验及临床研究资料表明,新生内膜增生是各种PCI术后RS的共同特征。内皮损伤后,在多种生长因子和细胞因子的作用下,中膜血管平滑肌细胞(VSMC)在短时间内发生表型转化和增殖(损伤后1天)并向内膜迁移(4～7天),内膜VSMC进一步增殖导致新生内膜形成及增生。因此,VSMC增殖是RS的主要病理机制的观点目前已得到公认。基本转录元件结合蛋白2(BTEB2)是一种锌指转录因子,它与基因启动子中GC序列结合,从而调节基因的表达。BTEB2在胚胎期动脉及内皮损伤动脉中去分化的VSMC中高效表达,在成年动脉及正常VSMC中无表达。生长剌激(生长因子、佛波酯、AngII等)可诱导其在VSMC中大量表达。现有的文献提示BTEB2可能在VSMC的增殖的过程中起重要作用,它可激活增殖相关基因(PDGF、CDK4、TGF-β、c-jun),并参与VSMC表型转化的调控。因此,以BTEB2为目标的干预性研究可能为再狭窄防治开辟新的途径。本研究拟通过腺病毒介导BTEB2反义RNA在培养VSMC中表达,抑制BTEB2蛋白表达,了解BTEB2反义RNA对体外培养VSMC增殖及其相关基因表达的影响;用反义BTEB2腺病毒载体转染球囊损伤后的大鼠颈动脉,于在体水平探讨BTEB2反义RNA对VSMC增殖及新生内膜增生的影响。研究方法:采用Ⅰ型胶原酶消化法进行大鼠主动脉VSMC原代培养;从对数生长期的VSMC原代大鼠VSMC提取总RNA,用RT-PCR技术扩增得到BTEB2 cDNA片段;采用位置特异性重组方法构建携带大鼠反义BTEB2基因的腺病毒载体Ad.ASBTEB2,通过293细胞扩增,纯化制取高滴度重组腺病毒。Ad.ASBTEB2转染培养VSMC后,用RT-PCR检测BTEB2反义RNA的表达;以蛋白质免疫印迹、免疫细胞化学及RT-PCR等技术检测分析BTEB2反义RNA对BTEB2、VSMC增殖相关基因(PCNA、AT1R、PDGF-BB)和表型标志基因(SMαA和SMemb)的蛋白及其mRNA表达的影响;用四唑盐(MTT)比色试验及流式细胞仪等方法检测BTEB2反义<WP=11>RNA对血清诱导的VSMV增殖的影响。建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,用Ad.ASBTEB2转染球囊损伤后的大鼠颈动脉,1～3周后进行病理切片,检测BTEB2反义RNA对新生内膜增生的影响;采用免疫组化技术检测BTEB2在新生内膜中的表达;用伊文氏蓝染色检测BTEB2反义RNA对损伤动脉内皮修复的影响。研究结果:①用位置特异性重组技术成功构建了携带携带大鼠反义BTEB2基因的腺病毒载体Ad.ASBTEB2,其滴度约5×1010pfu/ml;②在VSMC转染重组腺病毒Ad.ASBTEB2后各时相点,经RT-PCR均可检测到BTEB2反义RNA的表达;③与未转染组和Ad.LacZ组比较,Ad.ASBTEB2组各时相点的mRNA和蛋白表达明显减少(p<0.01);④MTT试验显示,在不同MOI组Ad.ASBTEB2组吸光度值均较未转染组和Ad.LacZ组显著降低(p<0.01),而且吸光度值降低的趋势随着MOI的增加而更加明显;⑤通过流式细胞仪检测VSMC增殖周期发现,转染Ad.ASBTEB2后可显著增加G0/G1期细胞(p<0.01)及减少S期和G2/M期细胞比例(p<0.01)。⑥免疫细胞化学检测结果显示,转染Ad.ASBTEB2可显著抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖相关基因PCNA、AT1R、PDGF-BB的蛋白表达;⑦免疫细胞化学及RT-PCR检测发现,Ad.ASBTEB2转染显著抑制VSMC去分化型标志基因SMemb蛋白及mRNA表达(p<0.01),并逆转血清诱导的分化型标志基因SMαA蛋白及mRNA的表达下调(p<0.01);⑧球囊损伤颈动脉内膜被伊文氏蓝染成明显的深蓝色,表明内皮损伤效果明显;损伤后1周新生内膜开始形成,2周以后新生内膜明显向管腔内增生造成明显的管腔狭窄;⑨在正常动脉VSMC中,通过免疫组织化学检测未见到BTEB2的表达;未转染组和Ad.LacZ组在球囊损伤后7和14天可检测到明显的BTEB2表达,损伤后21天BTEB2表达明显减少;在各时相点Ad.ASBTEB2组BTEB2表达均显著低于未转染组和Ad.LacZ组(p<0.01);⑩重组腺病毒对损伤动脉中层VSMC的转染效率约12%～30%;损伤后3周,与未转染组和Ad.LacZ组相比,Ad.ASBTEB2组的I/M明显降低(0.77±0.07 vs 1.63±0.36,1.81±0.21, p<0.01);损伤后3周Ad.ASBTEB2组的伊文氏蓝内膜蓝染百分比显著低于未转染组和Ad.LacZ组(p<0.01)。研究结论:①本实验构建的腺病毒载体Ad.ASBTEB2可介导BTEB2反义RNA在原代培养VSMC及球囊损伤的大鼠颈动脉中的表达;②Ad.ASBTEB2转染可抑制VSMC血清诱导的BTEB2过度表达及VSMC增殖;③Ad.ASBTEB2转染可抑制内皮损伤引起的大鼠颈动脉新生内膜增生,促进损伤内皮的修复。