苹果轮纹病是制约我国苹果产业发展的重要病害之一,由致病真菌Botryosphaeria dothidea引起。该病菌不仅能够侵染枝干,导致树体衰弱,还能侵染果实,形成同心轮纹病斑致果实腐烂；同时由于该病菌的潜伏特性,使苹果轮纹病成为果实贮运期的重要病害之一,致使苹果产量和品质急剧下降,造成严重的经济损失。植物在与病原菌漫长的协同进化过程中形成了极为复杂的抗病与免疫反应机制,使其能够针对特定病原菌的入侵而相应地激发植物抗病反应。经典的植物病理学研究表明：植物抗营活体寄生菌主要依赖于水杨酸信号转导途径,而抗营腐体寄生菌主要依赖于茉莉酸／乙烯信号转导途径。轮纹病菌属于兼性寄生菌,目前对该病菌与苹果互作的分子机制研究以及该病菌入侵后引起的抗病反应的研究,报道较少。因此,开展轮纹病菌与苹果果实互作的分子机制研究,对苹果抗病基因的挖掘、轮纹病菌防治机理的丰富和抗轮纹病新品种的培育均具有重要意义。本文以易感品种‘富士’果实为试材,首先研究了轮纹病菌B.dothidea在苹果果实中的扩展方式以及对苹果果实细胞的伤害；其次研究了乙烯信号分子在苹果果实发病中的作用,发现了乙烯在苹果果实与轮纹病菌互作中作为致病因子,促进果实发病；此外还发现转录因子MdWRKY33参与调控了苹果病程相关基因MdPRs的表达,并且介导了乙烯的致毒作用。主要研究结果如下：1.运用半薄切片与扫描电镜技术研究发现,B.dothidea侵入果实细胞后,菌丝大量存在于植物细胞壁与细胞间隙中。细胞壁降解为受B.dothidea侵染的苹果果实细胞的典型受害症状；部分受害细胞发生质壁分离；核染色质浓缩并聚集于核膜上,呈典型细胞凋亡症状。2.乙烯在轮纹病发病过程中作为致毒因子促进苹果果实发病。对不同成熟度与生理状态的三批果实,即‘富士’幼果、新鲜成熟果实与储藏果实,接种轮纹病菌后,施用乙烯抑制剂1-MCP,能够显著抑制果实发病；1-MCP对病斑的抑制作用呈现显著的浓度依赖性,1-MCP浓度越高,抑制作用越明显；相同浓度1-MCP对成熟果实病斑扩展的抑制效果最好；用外源乙烯预处理能够促进果实病斑扩展。3.在乙烯抑制剂1-MCP处理下,苹果病程相关基因MdPRs的表达进一步升高。B.dothidea能够诱导‘富士’幼果和新鲜成熟果中MdPR-5、MdPR-8和MdPR-4基因的表达,当用1-MCP处理接菌果实,病菌侵染诱导的MdPRs基因的表达进一步增强；而在储藏成熟果实中,轮纹病菌侵染却抑制了MdPRs基因的表达,1-MCP处理能够完全逆转轮纹病菌对MdPRs基因的抑制作用。此外,编码几丁质酶的MdChiB-1基因在幼果中不被轮纹病菌诱导,用1-MCP处理之后,其表达在轮纹病菌侵染下显著升高；新鲜成熟果实在1-MCP处理下,该基因的表达在轮纹病菌侵染下也进一步增强;而在储藏果实中,轮纹病菌对该基因的抑制作用被去除。因此,在1-MCP处理下,苹果病程相关基因MdPRs表达水平进一步升高,可能是增强苹果抗病能力,限制病斑扩展的重要因素。4.苹果转录因子MdWRKY33-1(MDP0000296025)的表达与病程相关基因MdPRs的表达高度协同。通过对19个转录因子做RT-PCR分析发现,B.dothidea只能诱导幼果中乙烯信号转录因子MdERF2的表达并且对幼果中MdERF3、MdERF98-3、MdERF98-6和MdERF98.7的诱导作用比对成熟果显著,1-MCP处理能抑制B.dothidea对ERFs的诱导表达；只有转录因子MdWRKY33-1的表达在接菌果实的乙烯合成和信号转导途径被抑制时,表达进一步升高,与MdPRs表达变化高度协同——在幼果中变化不大,在成熟果中表达量进一步升高,在储藏果中的表达抑制被解除；在各种激素和过氧化物等非生物胁迫下, ‘嘎啦’组培苗中的MdWRKY33-1与MdChiB-1、MdPR-5、MdPR-8、 MaPR-4这些MdPRs的表达变化也表现出了高度协同。5.MdWRKY33-1过表达能提高病程相关蛋白基因MdPRs的表达。转化苹果原生质体过表达ERFs和MdWRKY33转录因子,发现只有MdWRKY33-1能明显提高MdPRs的表达,说明MdWRKY33-1对MdPRs的表达起调控作用。6.在苹果果实中,轮纹病菌所诱导的乙烯合成途径与果实成熟过程中的乙烯合成途径不同。B.dothidea诱导的乙烯合成是通过影响MdACS5a,MdACS5b的表达来实现,与苹果果实成熟过程中乙烯的合成途径不同(MdACS1,MdACS3)。通过RT-PCR技术分析发现,负责介导由伤害胁迫引发的植物乙烯合成中的MdACS5a和MdACS5b基因的表达,能被轮纹病菌显著诱导,但轮纹病菌不能诱导负责果实成熟过程中乙烯合成与跃变的MdACS1和MdACS3的表达,说明B.dothidea诱导的果实乙烯合成与苹果果实成熟过程中的乙烯合成不同。乙烯受体基因MdERS1、MdERS2只在幼果中被B.dothidea诱导,在成熟果实中不被诱导,1-MCP处理能够抑制B.dothidea对它们的诱导作用；类似地,轮纹病菌对幼果乙烯受体基因MdETR2、乙烯转录因子MdERF98等的诱导比对成熟果显著,1-MCP处理均能显著抑制这些基因的表达,表明B.dothidea诱导的乙烯信号转导途径的调控与果实成熟进程有关。严格依赖乙烯的与果实成熟相关的MdPG1基因也能被轮纹病菌诱导,并受1-MCP显著抑制,进一步证实苹果果实响应轮纹病菌的乙烯信号转导与果实成熟进程有关。