研究背景及目的牙周病是一种感染性疾病,致病微生物、易感宿主和局部环境改变是牙周病发生和发展的三大因素。经典理论认为,牙周病是由牙菌斑及其产物(如脂多糖)作用于牙周组织,并通过激活宿主的炎症免疫反应,使牙周组织发生炎症或坏死的一种慢性或急慢性反复发作的进展性炎症性疾病。近年来,宿主的炎症免疫反应在牙周病进展中的作用已得到充分研究和肯定。Toll样受体家族(Toll like receptors, TLRs)是一种进化保守模式识别受体,它们通过识别病原体相关的分子位点,来激活先天性免疫系统产生炎症细胞因子,进而启动后天免疫系统反应。Toll样受体能识别多种病原体相关分子模式,Toll样受体家族中不同的Toll样受体识别不同的配体,其中TLR-2和TLR-4参与了细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LP S)的识别和信号转导,在LPS激发的炎症免疫中起着至关重要的作用,是细菌破坏细胞的关键途径。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是慢性牙周病的主要致病菌,在病情持续加重和治疗后复发的牙周病患者中其检出率增高。P.gingivalis分泌的毒力因子LPS,在CD14、LBP、MD-2等分子的协同下被TLR-4和TLR-2所识别,然后通过髓样分化因子-88(myeloid differentiation-88,MyD-88)依赖和MyD-88非依赖的信号传导途径将信号传导至细胞内,再诱发胞内一系列的相关因子反应,从而合成IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1、IL-12以及IFN-γ等细胞炎症因子,促使牙周组织炎症免疫反应持续加重或反复发作。牙周膜成纤维细胞是牙周膜中最重要的细胞,它具有分泌和收缩胶原、形成矿化、再生增殖和附着的生物学特性,是牙周组织再生修复的基础,同时也是形成牙周新附着的主要来源。在牙周病发生发展过程中牙周膜成纤维细胞受到炎症侵袭,发生病理性坏死或凋亡,最终导致牙周支持组织丧失,牙齿松动。故而促使牙周膜成纤维细胞有效地在根面附着、增殖和分化,使牙周组织生理和功能性再生,是牙周病治疗的根本。乳铁蛋白(lactoferrin, LF)是一种存在于人体多种组织中的糖蛋白,具有抗细菌、真菌及病毒等特性,参与构成非特异性免疫系统,也是口腔唾液防御系统的重要组成部分。乳铁蛋白可以直接对抗细菌的增殖和附着,或是通过干扰细菌LPS引发的TLR免疫反应来抑制内毒素毒性,进而抑制炎症发展。此外它还可以减少由LPS引发的炎症因子的分泌。抑制LPS激发的TLR反应从而调控相关的炎症反应,是近年来研究炎症治疗方法的热点。本研究旨在探讨乳铁蛋白对经LPS刺激的人牙周膜细胞表达TLR-4和TLR-2及其分泌IL-6和IL-8的影响,初步探索乳铁蛋白在牙周病免疫调节治疗方面的作用。第一章人牙周膜细胞的体外培养和鉴定目的体外培养人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs),观察人牙周膜细胞体外培养的形态特点及其鉴定。方法1.取15-22岁正畸志愿者牙周及牙体均健康的前磨牙,无菌条件下刮取根中三分之一牙周膜组织,组织块酶消化法进行原代培养并传代。取原代生长的hPDLCs及培养至第3代的细胞,倒置相差显微镜观察其生长形态及特征。2.取第3代hPDLCs,消化成密度为1×106·mL-1的单细胞悬液,分别加入小鼠抗人CD105、CD29、CD44、CD90单抗,室温孵育1h；洗涤后分别加入羊抗鼠Ig-FITC,室温避光45min; PBS洗涤3次,弃上清,加PBS重悬,流式细胞仪检测细胞表面分子表型。3.Ⅰ、Ⅳ型胶原的半定量PCR检测。取培养至第3代生长状态良好的hPDLCs制成单细胞悬液,以1×106·mL-1的密度接种于6孔板,待细胞达85%融合时,TRIzol法提取总RNA并逆转录为cDNA,进行半定量PCR反应。取PCR反应产物2μL,用1.2%质量琼脂糖进行凝胶电泳(100V,30min),用凝胶成像分析系统分析并拍照。4.MTT法检测hPDLCs的细胞活性：取对数生长期的第三代hPDLCs以2×103/孔的密度接种至96孔板。于各检测时间点加入20μ1MTT液,37℃避光孵育4h；用1ml注射器吸弃原培养液,每孔加入150μl二甲基亚砜,振荡溶解结晶(15min)；酶联免疫检测仪上测定各孔OD值(波长490nm),绘制生长曲线。5.茜素红染色法检测hPDLCs矿化能力：以1×106·mL-1/孔的密度将第三代hPDLCs接种于六孔板中,待细胞长至70%时,加入矿化诱导培养基,连续培养21d,茜素红染色,倒置显微镜下观察获取照片。结果1.组织块酶消化法分离培养hPDLCs游出率和成活率较高。形态学观察显示：游出细胞多为梭形和星形,体积较大,为成纤维细胞样细胞。传代细胞于24h后贴壁,贴壁后hPDLCs逐渐伸展为不规则圆形、多角形、梭形,且成放射状增殖。2. hPDLCs分子表型流式细胞分析显示：CD44、CD29、CD90和CD105标志的阳性细胞率分别为99.13、98.17、100和78.21,说明培养细胞为间充质来源。3.半定量PCR产物电泳结果见：Ⅰ型胶原阳性,Ⅳ型胶原阴性,此为牙周膜成纤维细胞特异性标记,证实培养细胞为牙周膜成纤维细胞。4. hPDLCs接种2天后细胞增长快速,7天的时候处于平台期,符合成纤维细胞生长规律。5.矿化诱导21d的hPDLCs,茜素红染色后可见大小不等的红褐色结节形成。第二章E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS刺激人牙周膜细胞区别表达TLR-4和TLR-2的研究目的比较牙龈卟啉单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖诱导人牙周膜细胞TLR-4和TLR-2表达,明确牙龈卟啉单胞菌脂多糖作为牙周病重要影响因子的重要性,为提供更接近牙周病临床病理模式的实验环境做准备。方法1.人牙周膜细胞的培养：同第一章。2.取第4代生长良好的hPDLCs,以1×106·mL-1接种于6孔板中,加入含1%双抗、10%胎牛血清的DMEM培养液,随机分成空白对照组、P.gingivalis-LPS组和E.coli-LPS组。待细胞密度至85%,空白对照组不加任何刺激；P.gingivalis-LPS组加入0.1μg·mL-1P.gingivalis-LPS, E.coli-LPS组加入0.1μg·mL-1E.coli-LPS,6h后TRIzol法提取各组总RNA。将各组总RNA分别逆转录合成cDNA,以β-actin为内参,然后进行荧光实时定量PCR反应,检测各组细胞TLR-4和TLR-2的基因表达。3.将生长良好的第4代hPDLCs以5×104·mL-1密度接种于每孔底部放有盖玻片的24孔培养板中,加入1ml含双抗和胎牛血清的DMEM培养液,37℃、5%C02、饱和湿度条件下培养至贴壁并基本铺满盖玻片后,弃原培养液,分别加入800μL含1%双抗、10%胎牛血清的DMEM,随机分成空白对照组、P.gingivalis-LPS组和E.coli-LPS组。空白对照组不加任何刺激,P.gingivalis-LPS组加入0.1μg·mL-1P.gingivalis-LPS, E.coli-LPS组加入0.1μg·mL-1E.coli-LPS。24h后收集各组细胞爬片,按步骤进行细胞免疫荧光化学染色法检测TLR-4和TLR-2的蛋白表达。4.统计学分析：所得数据用SPSS13.0软件进行单因素方差分析,检验水准α=0.05；进行方差分析前,先行Levene方差齐性检验。对方差齐性的资料采用Bonferroni法进行多重比较,方差不齐的资料用Dunnett’s T3法进行多重比较。结果1.qRT-PCR反应结果显示：未受刺激的人牙周膜细胞中TLR-4和TLR-2弱表达。E.coli-LPS、P.gingivalis-LPS刺激6h后hPDLCs的TLR-4mRNA表达均提高(P<0.001, P<0.05); E.coli-LPS刺激后TLR-4基因相对表达量比P.gingivalis-LPS刺激后TLR-4的表达更为明显(P<0.01)。两种脂多糖均能提高人牙周膜细胞TLR-2基因的表达,E.coli-LPS刺激后TLR-2表达与P.gingivalis-LPS组比较无显著差异(P=0.138)。2.细胞免疫荧光化学染色结果显示：空白对照组TLR-4和TLR-2呈弱阳性表达,E.coli-LPS、P.gingivalis-LPS刺激24h后TLR-4和TLR-2表达均明显增强。E.coli-LPS组TLR-4表达明显强于P.gingivalis-LPS组(P<0.05),而两组的TLR-2表达却无明显差别(P=0.071)。第三章乳铁蛋白对LPS刺激的人牙周膜细胞Toll样受体表达及炎症因子分泌的影响目的观察乳铁蛋白对经牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激的hPDLCs表达TLR-4和TLR-2的影响,检测乳铁蛋白对P.gingivalis-LPS刺激的hPDLCs分泌IL-6和IL-8的影响,探索乳铁蛋白能否调节脂多糖激发的牙周炎症免疫过程。方法1.人牙周膜细胞的培养：同第一章。2.取第4代生长良好的hPDLCs,以1×106·mL-1接种于6孔板中,培养24h至贴壁,随机分成空白对照组、LPS组、LPS+LF组。空白对照组不加任何刺激,且于0h用TRIzol法提取总RNA,-80℃冻存备用；LPS组加入0.1μg·mL-1P.gingivalis-LP S; LPS+LF组在加入LPS前2h,分别加入5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1浓度的LF。以加入LPS开始计算时间,分别于6h及24h,用TRIzol法提取各组总RNA。以各组总RNA为模板,分别逆转录成cDNA,然后进行荧光实时定量PCR反应,检测各组TLR-4、TLR-2、IL-6和IL-8的基因表达。3.取第4代hPDLCs,以1×106·mL-1接种于33mm2培养皿中,37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24h至贴壁,弃原培养液,加入含1%双抗、10%胎牛血清的DMEM,随机分成空白对照组、LPS组、LPS+LF组。空白对照组不加任何刺激,LPS组加入0.1μg·mL-1P.gingivalis-LPS; LPS+LF组在加入LPS前2h,加入10μg·mL-1LF。以加入LPS开始计算时间,24h及48h后收集各组细胞,提取总蛋白,然后进行Western Blotting analysis检测各组TLR-4和TLR-2的蛋白表达情况。4.取第4代hPDLCs,以1×106·mL-1接种于6孔板中,培养条件同上,随机分成空白对照组、LPS组、LF+LPS组。空白对照组不加任何刺激,LPS组加入0.1μg·mL-1P.gingivalis-LPS; LPS+LF组在加入LPS前2h,分别加入5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1浓度的LF,以加入LPS开始计算时间,6h后收集细胞培养上清液,按照步骤进行ELISA检测。5.统计学分析：所得数据用SPSS13.0软件进行单因素方差分析,检验水准a=0.05；进行方差分析前,先行Levene方差齐性检验；对方差齐性的资料采用Bonferroni法进行多重比较,方差不齐的资料用Dunnett’s T3法进行多重比较。结果1.0.1μg·mL-1P.gingivalis-LPS刺激6h后,hPDLCs TLR-4基因表达提高(P<0.05),加入5μg·mL-1LF的hPDLCs表达TLR-4与单纯LPS刺激组比较未见明显改变,而加入10μg·mL-1、20μg·mL-1浓度LF的两组,TLR-4表达均出现显著下降(P<0.01,P<0.05)。2. P.gingivalis-LPS刺激24h后,hPDLCs TLR-4基因仍保持高表达,而加入5μg·mL、10μg·mL-1、20μg·mL-1LF的各组,此时TLR-4表达均出现明显下调(P<0.05,P<0.001,P<0.01)。3. P.gingivalis-LPS刺激6h后,hPDLCs TLR-2基因表达比空白组明显提高(P<0.001)；加入浓度10μg·mL-1、20μg·mL-1LF的分组TLR-2表达与单纯LPS刺激组TLR-2表达比较均出现明显下降(P<0.001),而5μg·mL-1LF对TLR-2的表达无明显作用(P=0.271). P.gingivalis-LPS刺激24h后,TLR-2表达比空白对照组明显提高(P<0.001),而加入5μg·mL-1,10μg·mL-1、20μg·mL-1浓度LF的各组TLR-2表达均出现显著下降。4. Western Blotting analysis结果显示：刺激24h及48h后,LPS+LF组的TLR-4和TLR-2表达比单纯LPS刺激组的表达均显著下降。5.LPS刺激6h后,人牙周膜细胞分泌的IL-6基因表达比空白对照组高4倍,而加入LF的各组,IL-6表达与LPS组比较均出现显著下降(P<0.001)；ELISA检测显示：加入LF后,人牙周膜细胞IL-6的分泌显著下降(P<0.05)。6.LPS刺激的人牙周膜细胞IL-8的基因表达比空白对照组显著上升,加入LF后,各组IL-8的分泌均出现不同程度的下降,差异有统计学意义。结论1.组织块酶消化法培养hPDLCs游出时间一般为5-8d,且培养细胞成活率高,在多代培养后仍可以保持良好的细胞活性、增殖和矿化能力；结合分子表型流式细胞分析结果及半定量PCR产物电泳结果,说明培养的hPDLCs来源可靠,细胞纯度高.2.LPS刺激后人牙周膜细胞TLR-4和TLR-2的表达增强；E.coli-LPS刺激后hPDLCs表达的TLR-4比P.gingivalis-LPS刺激后表达的TLR-4明显,而两种LPS刺激后细胞TLR-2表达无明显差别；说明用牙周病主要致病菌牙龈卟啉单胞菌的脂多糖进行后续实验能提供更加接近临床病理模式的实验环境。3.LF对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的人牙周膜细胞TLR-4和TLR-2表达有下调作用；LPS刺激后人牙周膜细胞IL-6和IL-8的分泌明显增加,LF作用后降低LPS诱导的人牙周膜细胞IL-6和IL-8的分泌。预示着乳铁蛋白在调控LPS引发的牙周细胞炎症免疫反应方面有一定的作用。