肿瘤是对人类健康有着巨大威胁的遗传病,也是疾病研究领域的重要问题。虽然导致肿瘤的原因多种多样,但是癌基因突变的累积是肿瘤发生的最为重要的原因。然而,由于癌基因诱导的衰老(Oncogene induced cellular senescence,OIS)现象的存在,单个癌基因的突变激活并不会产生肿瘤,癌基因的激活还需要抑癌基因信号通路的紊乱与之配合,才会发生恶性转化的过程。OIS是由于原癌基因的激活引起初级细胞产生不可逆转的周期阻滞的现象,是体内和体外都存在的一种天然的抑癌机制。值得注意的是,尽管有OIS这一肿瘤的天然屏障存在,原癌基因引起的细胞转化仍然时常发生,以上事实提示着我们原癌基因存在一些逃逸衰老的机制。因此,癌基因逃逸衰老的机制以及癌基因和抑癌基因突变之间的协同作用一直是肿瘤研究的热点问题。在众多癌基因中,Ras家族是一类编码小GDP结合蛋白的原癌基因,Ras经上游信号激活后,通过信号转导并激活其下游通路,会给细胞带来较强的增殖信号。Ras家族的成员包括K-,N-,H-Ras,据文献报道,有近三分一的人类癌症中存在着Ras的持续性激活突变,因此,Ras及其信号通路是许多抗肿瘤药物的筛选与制备中的重要靶点。而在众多的抑癌基因中,p53(人类中由TP53基因编码)一直是研究人员关注的焦点。它是一种压力应激蛋白,也是转录因子。由于p53能够监测细胞内各种压力应激信号,并引起相应的周期阻滞,细胞凋亡等效应,从而维持细胞基因组的稳定性,因而p53蛋白被誉为“基因组卫士”。研究表明,约有一半的人类肿瘤中都发现了 p53基因的缺失或突变。约74%的p53突变是点突变,而大多数的热点突变往往发生在p53的DNA结合区域,这些突变通常会造成野生型p53功能的丢失。然而,研究发现有些p53突变不仅会丢失野生型p53的功能,还会产生功能性获得(Gain of function)并有利于肿瘤进展的过程。本课题的前期工作中发现,部分WS(Werner Syndrome,人类早老综合症)小鼠的的胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts,MEFs)在逃逸衰老后,具有在SCID小鼠中形成肿瘤的能力,在这些肿瘤中,我们都发现了同一个p53的突变,即p53N236S突变。p53N236S(人类中为N239S,以下简称p53S)是一个在p53 DNA结合区域发生的突变,它是由p53第236位的氨基酸由天冬酰胺突变为丝氨酸造成的。我们的前期研究表明,p53S突变不仅仅失去了野生型p53的功能,更是通过功能获得的方式具有了癌基因的潜能。根据 IARC(International Agency on Research of Cancer,R15)p53 突变数据库的数据显示,p53S这一突变形式广泛存在于各种类型的肿瘤中,而2016年的一篇关于癌症中突变多样性的文章显示,p53S这一突变同样属于p53的热点突变之一。我们的研究表明,在杂合子的p53N236S(p53S/+)小鼠中外源表达H-RasG12V会使细胞经历OIS的过程,并在随后逃逸衰老,更重要的是,将这些逃逸衰老的细胞注入SCID小鼠体内时可以形成肿瘤。此外,这些逃逸衰老的细胞还存在着杂合丢失的现象。随后,为了更加深刻的了解Ras逃逸OIS的分子机制,我们检测了 Ras相关的OIS的分子机制,并发现Ras-ERK和Ras-p38MAPK通路可能是p53S/+细胞诱导衰老的主要原因。此外,我们在后期逃逸衰老的细胞中发现了 PGC1-α(peroxisome proliferator-activated receptor γcoactivator 1α)的表达上调,并且随着PGC1-α的表达上调,细胞内的ROS水平有所下降。通过免疫荧光检测p53S蛋白在细胞中的定位发现,当过表达H-RasG12V时,p53S蛋白会从细胞质中转位到细胞核中。进一步的ChIP实验表明,p53S蛋白可以作为转录因子结合PGC1-α的启动子上。鉴于PGC1-α是一种重要的降低ROS的因子,它很有可能在逃逸OIS过程中起着重要的作用。综上所述,p53N236S和H-RasG12V在OIS以及逃逸OIS的过程中存在协同作用机制,并且这种机制可能依赖于p53S突变蛋白在转录水平上对于PGC1-α的调控作用。在细胞水平上初步探究了 Ras和p53S的协同作用之后,我们继续在动物水平研究了Ras家族的另外一个热点突变—K-RaSG12D与p53S的相互作用关系。_我们首先成功建立了AD-Cre病毒诱导的K-Ras p53S在肺部共同表达的小鼠模型。通过对这一模型肺部组织的WB和病理分析,我们发现K-Rasp53S/S小鼠肺部恶性增殖程度会随时间加剧,而在K-Ras p53-/+,K-Rasp53S/+小鼠中未发现这一现象。免疫组化检测病变部位的PCNA的结果显示,与K-Rasp53S/+基因型相比,K-Rasp53S/S、鼠肺部增殖细胞所占的百分比更高。以上结果表明K-Ras和p53S可能存在协同促进细胞增殖的作用。进一步研究发现,与K-Ras以及K-Rasp53s+小鼠肺部相比,K-Rasp53S/S小鼠病变肺部组织具有p-AKT被激活,DNA损伤应激相关蛋白p-ATM,CHK2,γ-H2AX降低,热休克应激降低,促凋亡相关蛋白BAX减少,抗凋亡蛋白BCL-2增加等特点。以上结果提示K-Ras在与p53S协同作用下,会削弱损伤应激相关途径。值得注意的是,在整体肺部蛋白水平上虽然没有检测到显著的凋亡现象,但是在TUNEL染色的组织切片中,K-Ras p53S/S小鼠病变肺部的凋亡程度显著低于K-Ras以及K-Ras p53S/+小鼠病变肺部。以上结果表明,K-Ras在与p53S可能协同减少了细胞转化过程中的损伤应激以及使细胞抗凋亡,从而使细胞获得了生存上的优势,共同完成了促进肿瘤的过程。综上所述,本研究在细胞水平上揭示了 p53S可能通过调控PGC1-α协同H-RasG12V逃逸OIS的过程,在小鼠水平上初步探明了 p53S可能通过使细胞抗凋亡,削弱损伤应激的过程来协同K-Ras促进肿瘤的进展过程。另外,本研究还揭示了 p53突变可能通过调控线粒体来参与到肿瘤转化过程中的这一新型途径。同时,我们的研究结果表明,由于p53S和Ras协同作用时会削弱损伤应激反应,所以在临床治疗过程中,对同时含有p53S和Ras突变的肿瘤,使用作用机理为诱导DNA损伤的药物可能治疗效果不会很理想,此时可能使用非DNA损伤机理的药物会取得更好的治疗效果。因此,本研究可能对于临床用药具有一定的指导意义。