离子霉素修饰的巨型囊泡内磷酸钙矿化过程及其影响因素研究

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基质囊泡(MVs)是骨矿物初始形核长大的场所,MVs膜转运蛋白调控矿化离子内流,p H值、矿化离子过饱和度、有机基质等因素参与调控磷灰石形核、生长和聚集等过程。但MVs内骨矿物磷酸钙矿化过程及相关影响因素的作用机制尚不清楚。离子霉素是一种具备Ca2+选择性转运的离子载体,以离子霉素修饰巨型囊泡(GUVs),不仅能模拟MVs矿化环境对磷酸钙的成核生长进行定域调控,而且还可以模拟MVs内Ca2+跨膜转运,研究囊泡内磷酸钙矿物晶体的形成和相转化过程,对充分认识体内骨矿物形成过程具有重要意义。本文以二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)和酸性磷脂二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)为膜材设计制备GUVs,研究相关因素对GUVs形成和稳定性的影响;探究p H值对囊泡内磷酸钙的物相转化过程的影响机理;以离子霉素修饰GUVs,构建具有载Ca2+离子功能的GUVs,研究Ca2+离子的跨膜转运及囊泡内磷酸钙的形成过程。以DOPC和DOPS为膜材设计制备了GUVs,考察了离子型磷脂DOPS含量、溶液p H、盐(Na Cl)离子浓度、琼脂糖交联度等因素对GUVs形成的影响。研究结果表明:20 mol%DOPS的添加,加速了脂膜之间剥离,囊泡粒径分布最均匀且最稳定,但DOPS含量超过30 mol%,静电斥力会阻碍小尺寸脂质囊泡的融合,不利于GUVs的形成。在p H为7.4的缓冲溶液中产生GUVs的速率最快。盐离子浓度的增加有利于脂质层的剥离,促进脂质融合形成GUVs,盐离子浓度为50 mmol/L时,脂质层迅速形成GUVs且粒径分布更均匀。琼脂糖分子之间交联程度越低,水化时与脂质杂化的琼脂糖分子肿胀速率越快,产生的渗透压越高,越有利于GUVs的形成。考察了p H对GUVs封闭体系内磷酸钙物相转化过程的影响。研究结果表明:在矿化前期,囊泡内p H处于4.0~6.0范围内,二水磷酸氢钙(DCPD)作为前驱相形成,随着矿化时间延长,OH-持续跨膜渗透泡内p H值升高。在p H为10.0时,囊泡内DCPD相转化为羟基磷灰石(HAp)相。p H值的变化主要改变了磷酸不同质子形式的相对浓度,从而改变了直接沉淀形成的磷酸钙物相组成。以离子霉素修饰GUVs,构建了具有载Ca2+离子功能的GUVs,实验考察了Ca2+离子的跨膜转运及其介导的磷酸钙矿化过程。研究结果表明:在p H为7.4~9.0时,离子霉素能快速转运Ca2+离子,配以4μmol/L离子霉素的GUVs能较快感知0.05~1 mmol/L浓度Ca2+离子。具有Ca2+选择性转运的GUVs介导的矿化过程是一个非均质成核过程,在囊泡空间限制下,无定形磷酸钙(ACP)的溶解速度减慢,在囊泡中存在时间延长。随着Ca2+离子持续跨膜转运,磷酸钙经历ACP-DCPD-磷酸八钙(OCP)的相转化过程。
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