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伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)ZYB002脂肪酶A欠佳的温度耐受性限制其使用效果和应用范围。提高酶蛋白的稳定性,对延长酶蛋白的货架半衰期,提高酶反应速率等具有重要的意义。本文借助FoldX、Rosetta和YASARA等软件,构建了脂肪酶LipA的热稳定性突变体电子文库。然后,结合LipA的3D结构信息,利用YASARA软件分析上述突变体电子文库,筛选出具有盐桥效应的突变体;利用定点突变技术构建具有盐桥效应的突变体,并测定其突变效应;筛选出热稳定性提高的突变体;并进一步构建叠加突变体(本课题组先前筛选出的部分热稳定性提高的突变体),筛选出热稳定性显著提高的突变体。具体实验结果如下:1.利用YASARA软件确定Burkholderiasp.脂肪酶LipA的活性中心区域,予以保护。使用FoldX和Rosetta软件对LipA活性中心保护区域以外的氨基酸位点进行虚拟饱和突变,根据突变前后解折叠自由能的变化值以及利用YASARA软件对各个突变体进行结构合理性目检,筛选出潜在的热稳定突变体,构建了一个包含341个突变体的电子文库。2.通过YASARA软件的“show interaction”功能,从上述突变体电子文库中筛选出27个存在盐桥效应的突变体。由于其中某些位点是突变成同种性质的氨基酸或引入突变后造成插入突变,因此实际成功构建了 20个突变体。经过诱导表达和热稳定性分析后,从20个突变体表达蛋白中筛选出3个热稳定性有明显提高的突变体:LipA-N125D、LipA-N125E和LipA-Q262E。相对于野生型脂肪酶LipA,它们的热半失活温度T5012值较野生型分别提高了 4.0℃、5.5℃和4.4℃;在55℃热处理下,半衰期较野生型分别提高了 1.2倍、2.8倍和1.6倍。3.从本课题组前期构建的五个饱和突变文库中,挑取热稳定性提高最为明显的突变体(LipA-E35P、LipA-L218E、LipA-V220E、LipA-F221D 和 LipA-V223D)与上述三个突变体(LipA-N125D、LipA-N125E和LipA-Q262E)分别进行叠加突变,构建了15个阳性双突变体。通过热稳定性分析,15个双突变体的热半失活温度T5012值较野生型都有明显的提高,提高的幅度从5.5 ℃(LipA-V223D/N125D)到11.1 ℃(LipA-F221D/N125E);半衰期较野生型提高幅度从 2.1 倍(LipA-V223D/N125D)到 49.57倍(LipA-F221D/N125E)。