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背景肺肾气虚证为慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)稳定期的主要证候,补益肺肾佐以祛瘀化痰为其主要治法,课题组前期经多中心临床试验研究表明,补肺益肾方联合舒肺贴治疗COPD稳定期肺肾气虚证患者取得了较好的临床疗效,能够改善临床症状、降低肺功能下降速率、减少急性加重次数、提高生存质量等,但其作用机制尚不明确。本研究基于COPD大鼠模型,从炎症反应方面探讨其作用机制,为临床应用提供依据。目的1基于COPD稳定期大鼠模型,从肺功能、肺组织病理和肺脏超微结构等方面评价补肺益肾方联合舒肺贴的疗效。2从炎症反应相关指标(炎症因子、氧化产物等)及相关炎症通路,如c-Jun氨基末端激酶/丝裂原活化蛋白激酶(Jun N-terminal kinase/p38 mitogen-activated protein kinases, JNK/p38MAPK)、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)γ等方面,阐释补肺益肾方联合舒肺贴的作用机制。方法120只SD大鼠随机分为空白组(CG)、模型组(MG)、穴位贴敷组(ASG)、补肺益肾组(BYG)、补肺益肾联合穴位贴敷组(BY+ASG)、氨茶碱组(AG)每组20只。采用香烟熏吸联合细菌感染法建立COPD稳定期大鼠模型。第9周开始给予相应药物处理至第20周,检测大鼠肺功能、肺组织病理、肺脏超微结构；采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定血清及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中白细胞介素(Interleukin, IL)-2、IL-6、IL-10.单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein, MCP)-1及肺泡表面活性蛋白(surfactant protein, SP)-A、SP-B、SP-C、SP-D表达；采用免疫组化测定肺组织炎症因子IL-2、IL-6、IL-10、MCP-1及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(Malon-dialdehyde, MDA)变化；采用荧光定量PCR法测定肺组织JNK、p38MAPK、PPARγ及SOD、SP-A、SP-B、SP-C、 SP-D mRNA变化；采用Western blotting法测定肺组织JNK、p38MAPK、PPARy及其磷酸化蛋白表达。结果1肺功能第8周起,MG肺功能(VT、PEF、EF50)均较CG明显降低(P<0.01)；第16周,ASG、BYG、BY+ASG、AG VT均较MG明显升高(P<0.01,P<0.05),BYG和BY+ASG EF50较MG升高(P<0.01,P<0.05)；第20周,BYG和BY+ASG VT、PEF、EF50均较MG升高(P＜0.01, P＜0.05), ASG仅EF50高于MG(P<0.05),AG仅VT高于MG(P<0.05)。2肺组织病理MG大鼠肺脏组织可见肺泡壁断裂融合、肺泡腔扩大、炎症细胞浸润、肺气肿征象明显,肺泡平均截距(mean linear intercept, MLI)较CG显著升高(P<0.01),平均肺泡数(mean alveolar number, MAN)显著降低(P＜0.01). ASG、BYG、BY+ASG和AG大鼠MLI较MG显著降低(P<0.01),MAN升高(P＜0.01); BYG MLI较ASG和AG降低,MAN升高(P＜0.01); BY+ASG MLI较其它组均降低,MAN升高(P<0.01)。超微结构方面,MG大鼠呼吸膜厚度较CG明显增厚(P＜0.01), BYG、BY+ASG和AG呼吸膜厚度较MG明显降低(P＜0.01), BY+ASG和AG较ASG降低(P<0.01, P＜0.05)。MGⅡ型细胞中可见少数较大的线粒体而线粒体嵴几乎完全消失,板层小体脱颗粒、空泡化；ASG Ⅱ型细胞中可见少数较小的线粒体及丰富而较大的呈囊泡状的板层小体；BYG Ⅱ型细胞中可见少数的线粒体及部分空泡化的板层小体；BY+ASG Ⅱ型细胞中可见大量而较大的线粒体及仅少量空泡化的板层小体；AG Ⅱ型细胞中可见较多的线粒体及大部分空泡化板层小体,线粒体嵴大多部分变短或减少。3炎症反应3.1炎症因子：MG大鼠肺组织、血清、BALF中IL-2、IL-6、MCP-1表达较CG明显升高(P<0.01),IL-10较CG明显降低(P＜0.01):ASG、BYG、BY+ASG和AG肺组织、血清、BALF中IL-2、IL-6、MCP-1较MG明显降低(P<0.01),IL-10升高(P<0.01)肺组织炎症因子：BYG、BY+ASG大鼠肺组织中IL-2、IL-6、MCP-1较ASG和AG降低(P<0.01),而IL-10升高(P<0.05,P<0.01)；AG大鼠肺组织MCP-1较穴位贴敷组降低(P＜0.01); BY+ASG肺组织MCP-1较BYG降低(P<0.05)。BALF炎症因子：BYG、BY+ASG BALF中IL-6较ASG降低(P＜0.01), IL-10升高(P＜0.05); BYG、 BY+ASG大鼠BALF中IL-2、IL-6较AG降低(P＜0.05, P＜0.01); BY+ASG大鼠BALF中MCP-1较BYG和AG降低(P<0.05)。血清炎症因子BY+ASG大鼠血清IL-2较ASG降低(P＜0.05), BYG、BY+ASG血清IL-10较ASG升高(P＜0.05, P＜0.01), IL-2、MCP-1较AG降低(P＜0.05, P＜0.01)。3.2 JNK/p38MAPK:MG大鼠肺组织JNK、p38MAPK mRNA和磷酸化水平均较CG明显升高(P＜0.01), ASG、BYG、BY+ASG和AG大鼠较MG降低(P＜0.05, P＜0.01), BY+ASG大鼠JNK mRNA较ASG降低(P＜0.05), p38MAPK mRNA较AG降低(P＜0.05)。BYG、BY+ASG和AG大鼠p38磷酸化水平均较ASG降低(P<0.05,P<0.01),BY+ASG较AG降低(P<0.05)。3.3 SOD、MDA:MG肺组织SOD积分光密度(IOD)和SOD mRNA较CG明显降低(P＜0.01),MDAIO D明显升高(P<0.01)；各治疗组SOD IOD较MG升高(P<0.01),MDA较MG降低(P<0.01)；BYG、BY+ASG和AG大鼠SOD IOD均较ASG升高(P＜0.01), BYG、BY+ASG较AG升高(P＜0.05,P＜0.01); BYG、BY+ASG大鼠MDA较AG降低(P<0.05, P<0.01); BY+ASG和AG肺组织SOD mRNA较ASG升高(P＜0.05), BY+ASG较BYG升高(P<0.05)。3.4 PPARy:MG大鼠肺组织PPARy mRNA、PPARγ蛋白及其磷酸化水平较CG明显降低(P<0.01),BYG、ASG、BY+ASG及AG较MG显著升高(P＜0.01),BY+ASG PPARγ mRNA较ASG升高(P<0.05), BY+ASG PPARγ、p-PPARγ蛋白较ASG和AG升高(P<0.05,P<0.01),BYG肺组织PPARγ蛋白表达较AG升高(P<0.05)。3.5肺泡表面活性蛋白：MG血清SP-A、B、C、D均较CG明显升高(P<0.01),各治疗组均较MG明显降低(P<0.01), BYG、BY+ASG较ASG降低(P<0.01),AG血清SP-C较ASG明显降低(P<0.01), BY+ASG血清SP-A、SP-C、SP-D较BYG和AG降低(P<0.05, P<0.01), BYG SP-D较AG降低(P＜0.01), BY+ASG血清SP-B较AG降低(P<0.01)。结论1补肺益肾联合舒肺贴治疗COPD稳定期具有较好的疗效,能够改善气流受限和肺组织形态损伤,表现在减轻支气管壁增厚、改善肺气肿,降低呼吸膜厚度、改善肺泡Ⅱ型上皮细胞的结构和功能等。2补肺益肾方联合舒肺贴能够降低COPD大鼠肺脏局部及全身系统性炎症因子IL-2、IL-6. MCP-1的表达,其抗炎作用可能与抑制fNK/p38 MAPK通路活化有关。3补肺益肾方联合舒肺贴能够提高COPD大鼠肺组织中PPARγ基因表达和蛋白磷酸化水平,提高血清和BALF中SOD活性、降低MDA表达,其疗效可能与活化PPARγ通路、增加抗氧化活性,从而减轻炎症反应有关。4 COPD大鼠肺泡表面活性蛋白合成、分泌异常,且与炎症反应和气流受限程度密切相关,补肺益肾方联合舒肺贴能够明显改善肺脏SP-A、SP-B、SP-C、SP-D表达,其疗效可能与调节肺泡表面活性蛋白表达,改善肺泡结构、减轻炎症反应有关。