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植物发育高度依赖于细胞分裂和增殖的精确调控,而细胞分裂和增殖的动态平衡与细胞周期的调控紧密相关,D类细胞周期蛋白(D-type Cyclin,CYCD)是连接细胞周期调控与植物生长发育的关键枢纽。CYCD基因调控细胞周期G1/S期转变,与细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-Dependent Kinase,CDK)结合形成CYCD/CDK复合物,被激活的CYCD/CDK复合物通过磷酸化下游细胞周期响应因子调控细胞周期有序进行,进而影响植物的生长发育。目前关于植物D2类Cyclin基因的研究主要集中在草本模式植物,在木本植物中尚未见报道。‘741杨’是以银白杨(Populus alba L)×[山杨(Populus davidiana Dode)+小叶杨(Populus simonii Carr)]的杂交品种为母本,毛白杨(Populus tomentosa Carr)为父本,经过2次有性杂交培育筛选出的白杨杂种无性系,具备速生、材质稳定、适应性广及冠形优美等特质。本论文以‘741杨’为研究材料,克隆得到两个D2类Cyclin基因:PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2,利用序列搜索及比对、系统进化分析、表达模式分析、蛋白定位分析和遗传转化等方法分析其生物学功能,研究杨树细胞周期蛋白调控细胞分裂的相关信号通路,主要结果如下:(1)PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2基因的c DNA包含1062和1041 bp开放阅读框,分别编码353和346个氨基酸。蛋白质结构域分析、系统进化分析、多序列比对和PEST预测等数据鉴定出这两个CYCD2基因属于D2类Cyclin。序列分析显示PtoCYCD2;1基因含有6个外显子,PtoCYCD2;2基因含有7个外显子,且在Cyclin＿C结构域中存在较多的单氨基酸突变。三维结构模拟显示两个蛋白在Loop区存在差异。这预示着PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2基因可能存在功能差异。(2)组织表达模式分析表明PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2基因在根、茎、叶、叶柄、木质部和树皮中均有表达,在叶中的相对表达水平最高。将PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2蛋白与绿色荧光蛋白连接,并在烟草中瞬时表达重组蛋白,发现这两个蛋白定位于细胞核,在细胞核内行使生物学功能。(3)与野生型(wild-type poplar,WT)相比,过表达PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2基因的‘741杨’出现株高降低,茎粗减小,叶片明显向远轴面方向卷曲的表型。扫描电镜分析(scanning electron microscope,SEM)显示在相同表面积内,转基因杨树叶片的上表皮细胞较WT平均面积变小,数量增多,形态不规则。树脂切片结果显示与WT相比,转基因杨树叶片的栅栏组织的细胞变短,海绵组织的细胞间隙疏松,叶片的背腹发育发生改变;且茎节的木质部呈现不同程度的减少,木质部发育受到影响。实时定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)结果表明转基因杨树中细胞周期蛋白依赖性激酶基因CDKA;1、CDKB1;1和CDKB2;1的表达水平显著上调,植物成视网膜细胞瘤相关蛋白1(retinoblastoma-related protein1,RBR1)基因、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(kip-Related Protein,KRP)基因表达水平显著下调。(4)对过表达PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2基因的‘741杨’进行形态学测定发现,两者在植物高度、茎粗、木质部及对部分细胞周期调节蛋白基因(KRP5)的调控方面存在显著差异,说明PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2基因在‘741杨’生长发育中出现功能差异。综合生物信息学、组织特异性表达、蛋白质定位的分析,以及探究其过表达对杨树生长发育和基因表达的影响,本文揭示PtoCYCD2;1和PtoCYCD2;2基因参与植物的细胞周期调控过程,通过促进细胞分裂影响杨树生长发育。但由于基因结构和遗传转化特性等方面的不同,这两个D2类Cyclin基因存在功能差异。本研究为进一步了解木本植物CYCD2基因的功能奠定了基础,希望能够为揭示杨属植物细胞周期调控机制提供新的资料。