论文部分内容阅读
背景:阻塞性睡眠呼吸暂停综合征在儿童较常见，严重影响儿童多器官功能，尤以神经系统为著，主要表现为认知功能障碍。有研究认为神经元细胞凋亡是阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)引起认知功能障碍的重要因素之一，而目前OSAHS引起神经系统病理生理变化机制未完全阐明。
目的:本研究通过观察慢性间歇性低氧对脑区腺苷酸活化蛋白激酶(The5-AMP-activated protein kinase，AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(MammalianTarget of Rapamycin，mTOR)通路的影响，进而明确这条通路与慢性间歇性低氧诱导神经元细胞凋亡的关系。从而为儿童OSAHS导致认知功能障碍的病理生理研究及治疗提供实验基础和理论依据。
方法:将SD幼鼠随机分为4组，分别为2周慢性间歇低氧组(2IH)和4周慢性间歇低氧组(4IH)、2周空气模拟对照组(2AC)和4周空气模拟对照组(4AC)，每组均8只。将慢性间歇性低氧组幼鼠放入低氧舱内，设置电脑参数90s为一次循环，使舱内最低氧浓度波动在(10.0±1.5)％，复氧时最高氧浓度波动在(21.0±0.5)％，监测CO2浓度，使其维持在小于0.01％，控制舱内温度22～24℃，湿度40～50％。将空气模拟对照组幼鼠放入空气模拟对照舱中，控制温度、湿度、CO2浓度与慢性间歇性低氧舱一致，舱内泵入压缩空气。所有舱体外侧用黑色布遮盖模拟黑夜，每天在舱内时间为7.5个小时，出舱后采用日光灯照射模拟白天。另取SD幼鼠予颈动脉留置针，每组5只，分别放入慢性间歇性低氧氧舱及对照舱内，在造模期间抽取动脉血并行动脉血气分析，根据血气分析结果判断模型是否成功。造模结束后取每组2只幼鼠，用多聚甲醛灌注后取脑，在视交叉后1mm及4mm处冠状切面切开，取中间脑块及前额皮层，包埋切片后行TUNEL法检测凋亡。取幼鼠左、右海马区及前额皮层区组织，用荧光实时定量PCR法测海马、皮层AMPK、结节性硬化复合物1(tuberous sclerosis complex-1，TSC1)、结节性硬化复合物2（tuberous sclerosis complex-2，TSC2）、mTOR mRNA表达，用western blot法检测海马、皮层通路上下游关键蛋白:磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)含量。
结果:
1.模型验证:动脉血气分析结果:模型组幼鼠动脉血最低氧分压(PO2)为(43±4) mmHg，最低氧饱和度(SaO2)为(76±3)％，血氧饱和度波动明显。对照组幼鼠动脉血气PO2为(96±1)mmHg，SaO2为(97±4)％，血氧饱和度差异不明显。
2.海马、前额皮层区神经元细胞凋亡指数结果:与2AC组比，2IH组海马、前额皮层区神经元细胞凋亡增多，差异有统计学意义(P＜0.05);与4AC组比，4IH组海马、前额皮层区神经元细胞凋亡增多，差异有统计学意义(P＜0.05);与2IH组比，4IH组海马、前额皮层区神经元细胞凋亡增多，差异有统计学意义(P＜0.01);2AC、4AC组比较海马、前额皮层神经元细胞凋亡指数差异无统计学意义(P＞0.05)。
3.实时荧光定量PCR法检测:(1)与2AC组比，2IH组海马、前额皮层区TSC1、TSC2、AMPK mRNA表达升高，mTOR表达下降，差异有统计学意义(P＜0.05);与4AC组比，4IH组海马、前额皮层区TSC1、TSC2、AMPK mRAN表达升高，mTOR表达下降，差异有统计学意义(P＜0.05);与2IH组比，4IH组海马、前额皮层区TSC1、TSC2、AMPK mRNA表达升高，mTOR表达下降，差异有统计学意义;2AC组、4AC组两组比较，海马、前额皮层区TSC1、TSC2、AMPK、mTOR mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)。
4.Western blot检测海马、前额皮层区关键蛋白p-AMPK和p-mTOR含量:(1) p-AMPK表达:与2AC组比，2IH组海马、前额皮层区p-AMPK蛋白含量增加，差异有统计学意义(P＜0.01);与4AC组比较，4IH组海马、前额皮层区p-AMPK蛋白含量增加，差异有统计学意义(P＜0.01);与2IH组比较，4IH组海马、前额皮层区p-AMPK蛋白含量增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。(2) p-mTOR表达:与2AC组比较，2IH组海马、前额皮层区p-mTOR蛋白含量下降，差异有统计学意义(P＜0.01);与4AC组比较，4IH组海马、前额皮层区p-mTOR蛋白含量下降，差异有统计学意义(P＜0.01);与2IH组比，4IH组海马、前额皮层区p-mTOR蛋白含量降低，差异有统计学意义。
结论:
1.慢性间歇性低氧导致幼鼠海马、前额皮层区神经元细胞凋亡，且与慢性间歇性低氧时间相关。
2.慢性间歇性低氧后，激活海马、前额皮层区AMPK，进而活化TSC1、TSC2，从而抑制mTOR活性，诱导细胞凋亡。