γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid (GABA))是一种从细菌等原核生物到植物、脊椎动物等高等生物中普遍存在且构象保守的非蛋白组成型四碳氨基酸。在哺乳动物中,GABA大量存在于中枢神经系统中且被证明是最主要的抑制性神经递质,它通过与分布于神经系统细胞膜表而的各种类型的受体相互作用来激活下游多样的信号途径。而GABA被证明是植物体氨基酸库中极为重要的组成部分,它广泛的存在植物体的各个组织中,细胞内和细胞外的GABA浓度对外界的生物和非生物压力起着显著而快速的应答效应,在外界胁迫作用下(冷,干旱,盐胁迫,氧压力,病虫侵害等等),植物体内的GABA水平有着显著的上升。研究表明这种GABA水平的上升能够调节细胞质PH的变化,进而调节一些受PH水平调节的酶的活力,建立起生化水平的植物保护机制。GABA还能作为植物中的一种重要N、C源参与植物体N、C代谢平衡的调节。同时,在受病虫侵害时,植物体内上升的GABA水平,会通过GABA对入侵病虫神经系统的干扰,影响病虫的发育和生存,到达抵御病虫害的目的。最近的研究表明GABA在拟南芥花粉管的导向中起着重要的作用,我们实验室前期的工作也显示在烟草的叶肉和花粉原生质体上存在着某种GABA的结合位点。一些GABA相关的芯片数据表明,GABA可能作为外源信号调节一系列基因的表达。这些研究暗示GABA在植物中的作用不仅仅作为一种响应机制而存在,还可能和动物中的GABA—样,作为一种重要的信号分子,参与植物体的各发育环节调控。鉴于以上最新的研究进展,本课题研究的主要目的是借鉴动物中GABA受体的发现历程和GABA受体的研究方法,探寻植物中可能存在的GABA受体,并且比对动物中GABA的信号转导模型研究植物中GABA作为外源信号分子所影响的下游信号事件。为此,我们设计了一系列的实验方案试图解答这些问题。1.我们选用了动物中GABAb型受体的激动剂分子CGP64213,并将这一分子与荧光基团bodipy偶联,用来检测这个小分子和植物细胞膜表面潜在的GABA受体分子是否可以结合。结果显示动物中的这种GABAB型受体结合探针不能和植物细胞膜表面结合,进一步印证了植物中没有和动物中同源的GABA受体序列,同时也说明了植物中的GABA受体可能和动物中的GABA受体结构上有较大的区别。2.由于动物中GABA B型受体被证明是以G蛋白偶联受体的形式行使作用,我们根据前期试验推测,植物中GABA受体可能也是G蛋白偶联受体。于是,通过蛋白表达纯化的方法,试图通过表达出植物少量的GPCR,然后进行体外结合实验,验证植物中GABA受体是否也是G蛋白偶联受体。结果表明,用原核表达系统无法表达这一类的多次跨膜蛋白。3.为了能够找到植物中的GABA受体,我们采用亲和层析的方法,将GABA偶联在一种新型的磁珠介质上,通过和拟南芥总蛋白的亲和层析,从总蛋白中钓取到了一条特异性的蛋白条带,通过质谱测序结果显示有18个候选蛋白,我们从中选取3个蛋白进行原核表达纯化,只有U-box44蛋白得到表达并且被纯化,我们使用纯化出来的这个蛋白和通过生物素-亲和素系统偶联在分子相互作用仪芯片上的GABA做表而等离子共振分析,发现U-box44蛋白没有和芯片上的GABA相互作用。说明该蛋白不是GABA的直接相互作用蛋白。4.我们借鉴了动物中GABA分子的作用机制在拟南芥和烟草两种模式植物中研究了外源GABA对花粉原生质体膜表而的钙离子通道的调节作用,利用全细胞膜片钳的方法发现外源的GABA对原生质体表面钙离子特异性通道的调节具有双峰效应,即低浓度的GABA对钙离子通道具有激活效应,而高浓度的GABA对钙离子通道具有显著的抑制效应。试验中加入钙离子通道的特异性抑制剂则导致这种调节效应消失,从而证实了这种钙离子通道的特异性。这一发现揭示了GABA在植物中作为信号分子的作用。5.基于上述发现,我们进一步检测了花粉管生长路径中最主要的部分花柱道的GABA浓度梯度是否存在?我们利用烟草拥有较长的花柱道的特点,通过分段测量花柱道中GABA含量,来验证烟草的花柱道中是否存在这样的GABA梯度。结果表明这个浓度梯度在花柱道中确实存在。验证了在植物花柱中的GABA浓度梯度对花粉管的生长和导向有重要的调节作用。我们的上述工作表明花柱中呈浓度梯度分布的GABA可以作为信号分子激活花粉细胞膜上的钙离子通道,从而指导花粉管生长和导向。这一机制提供了一个较完整的例证展示受精过程中花柱转导组织如何与花粉管相互作用以确保花粉管正常生长和导向。