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研究目的在全球范围内,细菌性脑膜炎(Bacterial Meningitis,BM)是感染密切相关的十大死亡原因之一,而肺炎链球菌(S.Pneumoniae,SP)是导致人类BM最主要和最常见的致病菌之一。肺炎链球菌性脑膜炎(S.Pneumoniae Meningitis,SPM)是由SP感染引起的脑脊膜炎症,可累及脑实质。SPM的主要病理改变包括软脑膜炎、脑膜血管充血、血脑屏障破坏、炎性细胞浸润、脑水肿及脑组织损害,且SPM患者的转归大部分取决于脑组织损害程度。治疗上即使给予针对性的抗生素等药物进行有效管理,但SPM依然存在较高的致死率及致残率,近一半幸存者遗留有认知功能障碍、听力下降,甚至引起瘫痪及癫痫等脑损害后遗症。因此,深入探究SPM的免疫病理机制,对改善疗效具有重要的临床意义高迁移率族蛋白B1(High Mobility Group Box 1 Protein,HMGB1)几乎在所有真核细胞的细胞核中普遍存在,是一种高度保守的核蛋白。研究发现在脑损伤疾病的患者中,HMGB1在BM患者的脑脊液中高度表达。凋亡诱导因子(Apoptosis Inducing Factor,AIF)为氨基酸序列高度保守的一种黄素蛋白,在感染性脑损伤中起重要作用。AIF定位于线粒体膜上,一旦细胞被凋亡信号影响时,AIF可使核染色质凝聚及非依赖caspase的DNA片段化,促使脑细胞凋亡。胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)主要分布在脑星形胶质细胞中,参与细胞骨架的形成。研究发现,GFAP在BM患者中的表达量显著增高,对早期BM的诊断具有重要价值。髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)是一种来源于中性粒细胞及单核巨噬细胞的钙离子结合蛋白,主要以异源二聚体MRP8/14存在并发挥生物学作用,是一种重要的内源性损伤相关分子。近年来,MRP8/14在感染性疾病方面的研究引起了高度的关注。研究显示在成人Still病、SLE及Crohn病等患者的血清中,MRP8/14浓度明显增高。但MRP8/14在中枢神经系统感染性疾病的作用我们知之甚少。研究发现,在SPM中,中性粒细胞来源的MRP14能诱导细菌清除以后的炎症反应但聚焦于更普遍存在的异源二聚体MRP8/14蛋白复合物在SPM病理生理过程中的作用及其机制研究可能更具有临床意义。本研究中,我们在前期工作的基础上进一步分析MRP8/14对SPM小鼠临床症状、脑组织病理变化及脑损伤标志物HMGB1、AIF、GFAP mRNA表达的影响,探讨MRP8/14对SPM小鼠脑损伤的影响,系统分析MRP8/14在SPM免疫病理损伤中的地位,研究结果将为寻找SPM除了抗生素疗法以外的免疫干预手段及改善本病的预后提供初步的实验依据。研究方法一、分析MRP8/14对SPM小鼠神经行为学变化、体质量改变的影响。1、分组:取48只健康雄性BALB/C小鼠,大小约为2月龄,随机分成4组:PBS组、MRP8/14组、SP组、SP+MRP8/14组;每组各有12只。腹腔麻醉后,向小鼠侧脑室定位注入40ul PBS+浓度为4.5×108cfu·mL-1的SP 5ul来制作SPM模型PBS组注射 45ul PBS;MRP8/14 组:5ul PBS+0.5ug/ul MRP8/14 40ul;SP 组:40ul PBS+4.5×108cfu·ml/1 的 SP 5ul;SP+MRP8/14 组:4.5×108cfu·mL-1 的 SP 5ul+0.5ug/ul MRP8/14 40ul。2、在侧脑室注入细菌建模6h、24h、48h后,对各组实验小鼠进行以下评估:1)神经行为学评分;2)体质量的改变。二、分析MRP8/14对SPM小鼠脑组织病理变化的影响。动物建模和分组同第一部分实验方法,在细菌注射6h、24h、48h后,对各组实验小鼠进行:1)脑含水量测定;2)Nissl染色评价脑组织神经元的损伤情况。三、分析 MRP8/14 对 SPM 小鼠脑组织 HMGBI、AIF、GFAP 的 mRNA 及 p-p38 MAPK蛋白表达的影响。动物建模和分组同第一部分实验方法，在细菌注射6h、24h、48h后,进行:1)采用Real-time PCR方法检测脑组织中脑损伤标志物HMGB1、AIF、GFAP mRNA的表达。2)免疫组织化学法检测小鼠脑组织p-p38 MAPK蛋白的表达。结果一、MRP8/14对SPM小鼠临床症状的影响1、临床评分:采用Loeffler神经行为学评分法,对每个实验组小鼠在6h、24h、48h时的临床表现进行综合测评。各时间点MRP8/14组的临床评分与PBS组比较,差异无统计学意义(P>0.05);6h的SP组临床评分与PBS组、SP+MRP8/14组临床评分与SP组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);24h、48h的SP组临床评分明显低于PBS组,差异具有显著性(P=0.000);24h、48h的SP+MRP8/14组的临床评分较SP组更进一步降低,具有显著性差异(P=0.000)。2、体质量变化(g):分别对各组各时间点小鼠注射前后体质量进行检测。各时间点MRP8/14组的体质量变化与PBS组比较,差异无统计学意义(P>0.05);6h的SP组体质量变化较PBS组、SP+MRP8/14组体质量变化较SP组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);24h、48h的SP组体质量较PBS组明显减轻,差异具有显著性(P<0.05);24h、48h的SP+MRP8/14组体质量较SP组更进一步减轻,具有显著性差异(P<0.05)。二、MRP8/14对SPM小鼠脑组织病理变化的影响1、脑含水量变化(%):分别记录各组各时间点干燥前后小鼠脑组织重量。各时间点MRP8/14组的脑含水量变化较PBS组比较,差异无统计学意义(P>0.05);6h的SP组脑含水量变化较PBS组、SP+MRP8/14组脑含水量变化较SP组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);24h、48h的SP组脑含水量明显高于PBS组,差异具有显著性(P=0.000);24h、48h的SP+MRP8/14组脑含水量较SP组更进一步升高,具有显著性差异(P=0.000)。2、脑组织Nissl染色:各时间点MRP8/14组和PBS组的Nissl染色阳性的神经元细胞数比较差异无显著性(P>0.05);不同时间点SP组Nissl染色阳性的神经元细胞数均低于PBS组,差异具有统计学意义(P＜0.05);SP+MRP8/14组Nissl染色阳性的神经元细胞数,与SP组比较,各时间点更进一步减少,具有显著性差异(P<0.05)。三、MRP8/14对SPM小鼠脑组织脑损伤标志物HMGB1、AIF、GFAP及p-p38 MAPK表达的影响1、Real-time PCR方法检测脑组织中HMGB1 mRNA的相对表达量:各组小鼠侧脑室注射6h、24h、48h后,各时间点MRP8/14组和PBS组的HMGB1 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05);不同时间点SP组HMGB1 mRNA的表达均高于PBS组,差异具有显著性(P=0.000);SP+MRP8/14组HMGB1 mRNA的相对表达量,与SP组比较,各时间点更进一步升高,具有显著性差异(P-0.000)。2、Real-time PCR方法检测脑组织中AIF mRNA的相对表达量:各组小鼠侧脑室注射6h、24h、48h后,各时间点MRP8/14组和PBS组的AIF mRNA相对表达量差异无显著性(P>0.05);不同时间点SP组AIF mRNA相对表达量均高于PBS组,差异具有统计学意义(P=0.000);SP+MRP8/14组AIF mRNA相对表达量,与SP组比较,各时间点更进一步升高,差异具有显著性(P=0.000)。3、Real-time PCR方法检测脑组织中GFAP mRNA的相对表达量:各组小鼠侧脑室注射6h、24h、48h后,各时间点MRP8/14组和PBS组的GFAP mRNA的相对表达量差异无显著性(P>0.05);不同时间点SP组GFAP mRNA的相对表达量均高于PBS组,差异具有统计学意义(P<0.01);SP+MRP8/14组GFAP mRNA的相对表达量,与SP组比较,各时间点更进一步升高,差异具有显著性(P<0.01)。4、免疫组织化学法检测脑组织p-p38 MAPK蛋白的表达:各组小鼠侧脑室注射6h、24h、48h后,各时间点MRP8/14组和PBS组的p-p38 MAPK的表达差异无显著性(P>0.05);不同时间点SP组p-p38 MAPK的表达均高于PBS组,差异具有统计学意义(P=0.000);SP+MRP8/14组p-p38 MAPK的表达,与SP组比较,各时间点更进一步升高,具有显著性差异(P=0.000)。结论1、本实验采用侧脑室注射法接种SP混悬液,成功构建了小鼠SPM模型。2、MRP8/14加剧了 SPM小鼠的临床症状,使小鼠临床评分降低,体重减轻;脑含水量增加;Nissl染色阳性的神经元细胞数减少;同时也使脑损伤标志物HMGB1、AIF、GFAP的mRNA相对表达量在SPM小鼠脑组织中明显升高。这些结果表明，MRP8/14加剧了 SPM小鼠的脑损伤并上调了上述脑损伤标志物分子mRNA水平的表达。3、MRP8/14上调了 SPM小鼠脑组织p-p38 MAPK蛋白的表达,推测MRP8/14促进SPM小鼠病情进展、加剧SPM脑损伤的机制可能与p38 MAPK信号通路活化有关。