番茄抗叶霉病Cf-16基因定位及抗病应答机制研究

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番茄叶霉病是由叶霉菌Cladosporium fulvum(C.fulvum)引起,在生产中是一种较为严重的真菌病害。一旦发病便迅速传播,最严重时番茄产量可减少80%,且对于保护地番茄的危害尤为突出,最有效的方法仍是培育含有抗病基因的抗病品种。目前,实际应用到育种生产中的抗叶霉病基因主要是Cf-5和Cf-9,但随着叶霉病生理小种不断且剧烈的分化,它们的抗性被新的生理小种逐渐克服。新的抗叶霉病基因的挖掘变得尤为关键,以便培育新的抗叶霉病品种,减少番茄生产中的损失,提高番茄的产量。含有Cf-16基因的番茄抗叶霉病材料Ontario7816在多年的田间鉴定中抗性表现良好,但目前对于Cf-16的研究较少,且尚未被克隆。本研究结合番茄抗叶霉病Cf-16基因的抗性范围和抗性遗传规律的研究、Cf-16与C.fulvum的互作过程观察及相关生理指标的测定分析、以及Cf-16基因的定位和Cf-16与C.fulvum互作的转录组测序分析,综合且全面地对Cf-16基因进行分析和挖掘,为今后Cf-16基因的克隆、育种应用以及全面揭示Cf基因的抗叶霉病机理提供理论基础。本研究的主要研究结果如下:(1)通过人工接菌鉴定明确了番茄抗叶霉病Cf-16基因的抗性范围,结果表明含有Cf-16基因的抗病材料Ontario7816对C.fulvum的抗性表现良好,结合本实验室之前的研究结果,该材料共对10个生理小种表现为抗病。(2)构建了Ontario7816与Moneymaker为亲本的6世代群体,并对F1、F2及BC1P2回交群体进行了接菌鉴定,结果表明:F1代表现为全部抗病,F2代和BC1P2群体中的Cf-16基因的抗、感分离比分别符合3:1和1:1的孟德尔分离定律,明确了Cf-16基因对C.fulvum的抗性是由单基因控制的显性遗传。(3)分别对抗、感材料Ontario7816和Moneymaker与C.fulvum之间的互作过程进行了台盼蓝染色观察,结果表明Ontario7816在C.fulvum侵染后表现出强烈的HR反应,而Moneymaker则体现为菌丝持续的生长与繁殖。(4)基于台盼蓝染色的观察结果,我们确定了4和8 dpi(day post inoculation)这两个重要的时间节点并进行转录组测序。(5)对C.fulvum侵染后抗、感材料植株叶片于不同时间点的相关生理指标进行测定。C.fulvum侵染后抗、感材料中活性氧ROS含量均有所升高,三种保护酶(SOD、POD和CAT)被激活,活性升高,且抗病材料的升高趋势更为明显。C.fulvum侵染后抗病材料Ontario7816的SA和JA含量均呈上升趋势,且JA含量在接菌前期迅速上升。(6)通过亲本重测序结合BSA关联分析,将Cf-16基因定位于番茄6号染色体上。随后通过ΔSNP-index并结合SSR分子标记,得到了两个与Cf-16基因紧密连锁的SSR标记TGS447和TES312,遗传距离均为1.3c M。该区间的物理距离为3.63Mb。对候选区间内的基因进行多种数据库的功能注释,得到了2个可能与已克隆的Cf基因LRR-TM结构相似的候选基因XM_004240667.3和XM_010323727.1。(7)对接种C.fulvum后4和8 dpi的抗病材料Ontario7816与感病材料Moneymaker进行RNA-Seq。在响应C.fulvum侵染的过程中,抗、感材料在4 dpi时都发生了剧烈的转录变化。最显著富集的GO类别与细胞壁的组织或其组成部分代谢相关。绝大多数的DEGs显著富集于植物激素信号传导和植物与病原菌互作通路。Map Man分析的结果表明上调的DEGs主要包括R基因、MAPKs、PR蛋白、TFs以及与乙烯、ABA、SA和JA等激素相关的基因。在植物与病原菌互作通路中编码RPM1的基因109120689、101253178和BGI_novel_G001591极有可能是抗叶霉病基因的候选基因。通过初步的比较分析,在C.fulvum侵染的早期阶段,Cf-16番茄中检测到的上调表达DEG的数量明显多于Cf-10、Cf-12和Cf-19。
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