随着纳米粒子在生物医学领域中的应用日趋广泛,纳米粒子对人体健康的影响即纳米毒性引起了人们的密切关注。虽然研究者已采用多种方法从不同层面研究了纳米粒子的毒性,但目前人们对纳米粒子与活细胞的相互作用仍知之甚少,更重要的是采用动物整体实验、细胞学实验和传统分子生物学方法不能系统全面地解释纳米粒子与细胞相互作用的机理。高通量生物组学技术(基因表达谱芯片技术、蛋白质组学技术、SOLiD测序技术等)的快速发展为全面、系统地在分子水平上研究纳米粒子毒性机理提供了新方法和新技术手段。但迄今为止,对纳米粒子作用后引起的细胞中基因、蛋白质、microRNA表达谱的变化都是采用单一的生物组学方法分别进行研究的,因此只能获知纳米粒子对细胞影响的一个方面,而无法对纳米粒子的毒性进行系统整体的分析。纳米银由于效果强、杀菌光谱,在医学领域获得了广泛的应用,但由于纳米银对生物系统影响的复杂性,其毒性作用还有许多方面未被揭示。目前已有研究者开始研究纳米银对细胞内基因、蛋白质表达谱的影响,但尚未见对细胞中microRNA表达谱影响的报道,也未见联合多种生物组学方法系统研究纳米银毒性机制的报道。本论文将通过对将基因、microRNA、蛋白质表达数据的联合分析,探讨microRNA在纳米银对人皮肤成纤维细胞毒性中的调控机制。本论文的具体内容如下：1、采用硼氢化钠还原硝酸银的方法制备纳米银,通过调节硼氢化钠的浓度和改变溶剂的种类制备一系列纳米银溶液。紫外可见分光光度计和透射电镜表征结果显示,还原剂的浓度和溶剂的种类均会影响纳米银的大小和形状。用二蒸水制备的纳米银形状均一,大部分呈球形。为了获得实验用20nm的纳米银,确定以二蒸水为溶剂、浓度为2mM的硼氢化钠和硝酸银溶液进行制备。2、采用MTT法、实时细胞电阻抗仪、光学显微镜、荧光显微镜和扫描电镜对纳米银对人皮肤成纤维细胞增殖和形貌的影响进行分析,采用流式细胞术研究纳米银对细胞周期和细胞凋亡的影响,进一步采用原子吸收光谱仪分析纳米银在细胞中的摄取。结果显示,低浓度的纳米银(1、10、50、100μM)作用细胞72h内,细胞毒性均为0级,高浓度纳米银(200、300μM)在作用细胞48h后均出现1级细胞毒性,且细胞的规则排列发生变化。而200μM纳米银作用细胞1、4、8h时虽未产生细胞毒性,影响细胞形态,但已使细胞滞留于DNA合成期,且在8h时纳米银对细胞周期和凋亡的影响最为显著。此外,随着作用时间的增加,细胞中摄取的纳米银量显著升高。3、采用基于二维差异凝胶电泳分离技术和质谱鉴定的蛋白质组学技术研究200／μM纳米银作用1、4、8h后人皮肤成纤维细胞中的蛋白质表达谱,筛选获得25种在三个时间点均发生差异表达的功能蛋白质,其中发生上调表达的蛋白质19种,发生下调表达的蛋白质4种,既有上调又有下调的蛋白质2种。进一步采用Cluster & Treeview, Gosurfer、GenMAPP、Ingenuity Pathway Analysis软件对差异表达蛋白质进行聚类、Gene Ontology (GO)功能分类、生物学通路和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析,发现25种差异表达蛋白质影响多个GO功能类别,并参与31条生物学通路和4个蛋白质相互作用网络。纳米银可能影响细胞信号传导、细胞骨架、细胞粘附、细胞能量代谢、mRNA加工等功能,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。4、采用SOLiD测序技术分析2001μM纳米银对人皮肤成纤维细胞中microRNA表达谱的影响,在1、4、8h三个时间点分别获得59、143和142个差异表达microRNA,其中不重复的共有246个。进一步使用miRanda、TargetScan和PicTar三种方法同时对差异表达microRNA进行靶基因预测,在三个时间点分别获得1747个、2928个和2667个靶基因,其中不重复的共有3594个。生物信息学分析发现,差异表达microRNA靶基因显著影响171、272、233个生物学过程、分子功能和细胞组分第三层次的功能类别,并参与120、132和129条生物学通路,其功能涉及细胞粘附、细胞骨架、细胞凋亡、细胞周期、炎症反应等。5、将纳米银作用细胞后的蛋白质表达数据和本课题组前期获得的基因表达数据进行比较,发现两者在种类、数量和表达模式上都存在明显差别。对比差异表达基因、microRNA和蛋白质涉及的GO生物学过程功能类别和参与的生物学通路,发现三者之间存在差异。通过联合分析microRNA、基因和蛋白质表达数据,在1、4、8h三个时间点分别匹配到具有生物学意义的microRNA-靶基因作用对36、429、116个,microRNA-靶蛋白质作用对2、1、3个,包含的靶基因和靶蛋白质有28、186和82个,不重复的共257个。在匹配到的microRNA-靶基因／靶蛋白质对找到对应3个基因／蛋白质对的6个microRNA,而靶基因-蛋白质对的表达分别受多个microRNA的共同调控,microRNA本身的表达方式也会影响其对靶基因／靶蛋白质的调控效果,microRNA可通过降解mRNA和抑制翻译两种方式发挥对靶基因-蛋白质对的调控作用。对257个microRNA靶基因／靶蛋白质的生物信息学分析显示,其功能主要与细胞通讯和细胞代谢过程有关,并且参与57条生物学通路。而差异表达nicroRNA和调控的靶基因-蛋白质对共同参与4条主要的生物学通路,即“肌动蛋白细胞骨架的调节”、“肝细胞生长因子受体”、“胰岛素信号”和‘’MAPK信号通路”。纳米银可能通过差异表达microRNA调控这4条通路中的靶基因和靶蛋白质,最终导致细胞骨架的破坏、ATP水平的降低和细胞凋亡的产生。6、采用Western blot和qRT-PCR对选定的4种蛋白质和8个microRNA的表达值进行测定,证实纳米银与细胞作用的蛋白质组学和nicroRNA测序实验结果的可信性。进一步采用肌动蛋白细胞骨架染色试剂盒、ATP检测试剂盒和Hoechst荧光染色法对纳米银作用1、4、8、24、48和72h后细胞骨架、细胞内ATP含量和细胞凋亡进行分析,证实生物信息学分析结果,证明纳米银主要通过破坏细胞骨架、降低ATP水平和诱导细胞凋亡这三个方面的作用引起人皮肤成纤维细胞毒性。7、采用SOLiD测序技术分析200μM纳米金对人皮肤成纤维细胞中microRNA表达谱的影响,在1、4、8h三个时间点分别获得109、78和124个差异表达]microRNA。进一步使用miRanda, TargetScan和PicTar同时对差异表达microRNA进行靶基因预测,在三个时间点分别获得2403个、2044个和3002个靶基因,这些靶基因显著影响208、193、249个生物学过程、分子功能和细胞组分第三层次的功能类别,并参与126、125和129条生物学通路。通过联合分析microRNA、基因和蛋白质表达数据,在1、4、8h三个时间点分别匹配到具有生物学意义的microRNA-靶基因／蛋白质作用对132、38、137个,包含的不重复的靶基因和靶蛋白质共187个。对匹配的187个microRNA靶基因／靶蛋白质的生物信息学分析显示,其功能主要与细胞代谢过程有关,并且参与71条生物学通路。而差异表达microRNA和调控的靶基因-蛋白质对共同参与2条主要的生物学通路,即"mRNA加工”和"MAPK信号通路”。纳米金可能通过差异表达microRNA调控这2条通路中的靶基因和靶蛋白质,影响细胞周期但抑制细胞凋亡。8、从细胞水平、蛋白质水平和microRNA水平对纳米银与纳米金对人皮肤成纤维细胞的影响进行比较。结果发现,这两种纳米粒子对细胞增殖、细胞周期、细胞骨架、氧化应激、能量代谢、细胞凋亡等方面的影响均存在差异。进一步在蛋白质水平上的比较发现,这两种纳米粒子诱导的差异表达蛋白质中相同的只有5种,生物学过程、分子功能、细胞组分分类中包含蛋白质最多的类别基本相同,而纳米银影响的通路数量(31条)多于纳米金(24条)。在]microRNA水平上的比较显示,纳米银和纳米金作用细胞后差异表达microRNA的种类、靶基因／靶蛋白质功能、参与的生物学通路和对生物学通路的影响均不同。与纳米银相比,纳米金影响细胞周期,减弱对ATP合成的抑制和对细胞骨架的损伤,并抑制细胞凋亡的产生,最终未产生细胞毒性。而两种纳米粒子作用后细胞中活性氧水平的差异与纳米金无细胞毒性而纳米银诱导产生细胞毒性有关。