目的:1.将比格犬作为实验动物,用自行设计的牵引装置进行缝牵引成骨实验,模拟人缝牵引成骨治疗面中份发育不全的过程,希望建立一种可靠的的面中部骨缝牵引动物模型,为后续研究缝牵引成骨的相关机制提供基础。2.本课题以腺病毒为载体,应用基因治疗的手段将Ad-BMP2转染至骨髓间充质干细胞,研究其对缝牵引成骨的促进作用,从而为早期治疗颅颌面骨畸形缩短缝牵引成骨治疗周期提供理论依据。方法:1.4-5个月比格犬3只,随机分为实验组2只和对照组1只。实验组于双侧颧颞缝、颧上颌缝、腭横缝植入种植钉作为骨标志点,以犬尖牙窝作为面中部骨骼的承力点,采用头颅外牵引架进行牵引,每侧800g力,弹性牵引15天。对照组仅于骨缝两侧植入种植钉作为骨标志点。通过游标卡尺和X线检查测量骨缝两侧种植钉之间的距离来证实牵引所致的改变;头影测量测量颅底角角度变化分析牵引方向;HE染色在显微镜下观察骨缝宽度、细胞及新生骨组织形态与结构。2.全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,进行成骨、成脂诱导鉴定,CCK-8测定P3细胞生长曲线;测定Ad-BMP2最佳感染复数,取以最佳感染复数感染后第3天的细胞行qRT-PCR、Western-blot检测目的基因的表达;14只比格犬面中部经缝牵引15天左右进入固定期,实验分为3组,每组4只比格犬,牵引完成后即刻于双侧颧颞缝A组注射等量生理盐水、B组注射未转染BMP-2的BMSCs、C组注射转染Ad-BMP2的BMSCs并维持牵引2周、4周。按照预设时间节点(牵引完成后即刻2只,2、4周时A、B、C三组各2只)处死动物并取材,行HE染色并测量骨缝宽度及骨小梁厚度、Masson染色观察骨成熟程度、Ⅰ型胶原免疫组化染色并测量IOD值,进行统计学分析。结果:1.实验组比格犬牵引架性能稳定、固位良好。实验组比格犬牵引过程中上颌逐渐前突,咬合关系逐渐变为Ⅱ类错合。牵引15天时可见前牙覆盖距离约为8-9mm。牵引前后游标卡尺和X线测量各骨缝标志点间的距离示:腭横缝骨标志点间距扩增最大,颧颞缝次之,颧上颌缝扩增较少。术前术后头影测量颅底角基本变化不明显,上颌基本为平行前移。组织学显示:对照组骨缝胶原纤维较致密,缝边缘可见成骨细胞,显示有成骨活动;实验组骨缝增宽明显,成纤维细胞数量明显增加,胶原纤维疏松,细胞和纤维排列方向基本一致,与牵引力的方向趋于平行,小血管和骨髓腔较多,骨缝周围骨小梁较薄,显示活跃的成骨活动。2.成功分离培养骨髓间充质干细胞,成骨诱导21天后茜素红染色阳性,成脂诱导20天后油红O染色阳性。CCK-8结果P3代BMSCs生长曲线呈“S”形,具有较强的增殖能力。qRT-PCR结果显示Ad-BMP2转染BMSCs组与BMSCs组相比BMP-2基因表达增加(P<0.05);Western blot结果表明Ad-BMP2转染BMSCs组BMP-2蛋白表达增加。HE染色示A、B、C三组骨缝宽度依次变窄、骨小梁厚度依次增加,且任意两组间骨缝宽度、骨小梁厚度差异均有统计学意义(P<0.05);0周、2周、4周骨缝宽度逐渐减小、骨小梁厚度逐渐增加,且任意两个时间点之间骨缝宽度、骨小梁厚度差异均有统计学意义(P<0.05)。Masson染色见固定4周时B组骨缝周围红染区多于A组,C组较A、B组明显增多。Ⅰ型胶原免疫组化染色IOD值测量结果表明A、B、C三组IOD值依次增加,且任意两组间IOD值差异均有统计学意义(P<0.05);0周、2周、4周IOD值先升高后降低,且任意两个时间点之间IOD值差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:1.幼年比格犬可用于建立经缝牵引动物模型进行实验研究;本实验自行设计的头颅外牵引架牢固稳定,价格低廉,牵引效果满意,可应用于后续实验中;实验中利用克氏针贯穿上颌骨梨状孔底平面(后方约为尖牙窝的位置)可达到牵引力矢量与抗力中心接近的效果,牵引方向与生长方向基本一致,上颌骨基本上是平行前移的。2.全骨髓贴壁法培养的骨髓间充质干细胞具备成骨成脂分化能力,增长能力良好;Ad-BMP2可成功转染至骨髓间充质干细胞并表达分泌BMP-2,BMSCs可作为基因治疗的种子细胞;BMSCs可以促进骨缝牵引区新骨形成与改建,Ad-BMP2转染的BMSCs促进效果更加显著,临床应用可能缩短缝牵引成骨的治疗过程。