炎症性肠病(IBD)是一种肠道的非特异性慢性炎症,主要包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。炎症性肠病是第二大最常见的炎症性疾病,影响全球数以百万计的人,发病率每年都在增长。到目前为止,IBD的病因还没有完全研究清楚,一般认为是由遗传、环境、微生物和机体免疫系统的相互作用造成的。目前,IBD治疗所用的药物包括氨基水杨酸盐、糖皮质激素、免疫调节剂和抗生素等。这些药物治疗存在许多不足,如免疫抑制剂和抗炎药治疗过程中出现腹泻、痉挛、腹痛并伴有发热和高血压等副作用；抗生素的使用可能会改变肠道内微生物生存的条件。同时也有研究发现治疗IBD的部分药物如柳氮磺吡啶、美沙拉嗪和硫唑嘌呤等可导致急性肝损伤,甚至肝衰竭。因此,临床上需要治疗效果好、副作用小的药物用于预防或治疗炎症性肠病,在筛选炎症性肠病治疗药物时,降低药物肝损伤的毒副作用的研究也是评价创新药物的重要组成部分。本课题所评价的具有治疗炎症性肠病的活性化合物甲基烯丙基二硫醚(AMDS)来自大蒜。大蒜不仅具有杀菌、抗菌的作用,同时流行病学研究表明,大蒜中一些硫化物能够降低癌症的风险,对心血管系统疾病也具有一定的作用。此外也有研究发现其中一些硫化物还具有保肝和抗炎的作用。大蒜的许多药理作用得益于其中的硫化物,不同的硫化物具有不同的药理作用,目前,大蒜中的一些硫化物(如大蒜素)已经成功开发为药物制剂。AMDS是大蒜众多有机硫化物中的一种,但是关于AMDS对炎症性肠病治疗的药理活性以及制剂开发方面的研究均未见报道。因此本课题首次对AMDS用于炎症性肠病的初步治疗以及固体制剂制备进行研究,以期为AMDS用于肠道疾病的临床应用提供一定的理论依据。本课题的内容包括四个方面。第一,AMDS的药理活性评价,主要考察AMDS对于炎症性肠病的治疗作用和作用机制以及对药物引起的急性肝损伤的保护作用；第二,AMDS的基本性质评价；第三,AMDS的固化工艺和肠溶制剂进行初步研究,通过不同固体化工艺制备AMDS三种固体剂型,进一步制备肠溶制剂并对其评价；第四,AMDS制剂生物药剂学的初步研究,对主要代谢产物进行了鉴定,并对AMDS制剂的的代谢产物的药动学过程进行了研究。AMDS用于肠炎治疗的初步体外作用及机制研究涵盖HT-29和Caco-2体外细胞模型的构建,细胞因子IL-8和IP-10的抑制作用评价以及NF-κB信号通路研究。采用SRB法和测定细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平两种方式考察AMDS对于细胞活性的影响；用ELISA实验考察TNF-α对两种细胞在不同时间点IL-8和IP-10分泌量的影响,同时考察AMDS对于两种细胞分泌的IL-8和IP-10影响；采用RT-PCR方法考察AMDS对于TNF-α的诱导HT-29细胞IL-8 mRNA水平影响,采用Western blotting方法考察AMDS对于TNF-α诱导的NF-κB的表达情况以及用免疫荧光方法考察NF-κB-p65转移情况。SRB法和LDH实验结果表明在0～150μM的浓度范围内,AMDS对于细胞增殖活性没有影响；而TNF-a对两种细胞IL-8和IP-10影响测定结果发现,随着时间的延长两种细胞因子分泌量越来越多,具有时间依赖性,24h达到最大,表明TNF-a能够诱导这两种细胞产生炎症细胞因子。AMDS对TNF-a诱导两种不同细胞中分泌的IL-8和IP-10作用结果表明,采用不同的浓度AMDS预孵育细胞3小时能显著降低因TNF-a诱导升高的IL-8和IP-10水平,且具有浓度依赖性。AMDS对于TNF-a的诱导HT-29细胞IL-8 mRNA水平的实验结果表明,AMDS能显著的抑制TNF-a诱导的IL-8的mRNA的积累,而对管家基因GAPDH的mRNA水平没有影响。Western blotting以及免疫荧光的结果表明,AMDS能抑制NF-κB中的κBα蛋白的降解及NF-κBp65蛋白的转移。这些研究结果表明AMDS可以抑制结肠细胞炎症细胞因子的分泌,抗炎作用调节途径有一部分可能是通过NF-κB信号通路完成的。AMDS用于肠炎治疗的作用及机制的体内初步研究包括大鼠肠炎模型的构建、细胞因子和抗氧化酶的评价以及NF-κB信号通路研究。采用三硝基苯磺酸(TNBS)构建肠炎大鼠模型,考察大鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-8及IL-10变化,同时测定结肠中的生化指标髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX),采用病理组织切片观察结肠病变情况,免疫组化方法考察结肠中NF-κB的表达情况。实验结果表明TNBS模型组的大鼠血清中TNF-α、IL-8显著升高,IL-10则显著降低。AMDS预防组和治疗组与模型组比较,TNF-α及IL-8水平均显著下降,而IL-10水平升高。结肠中生化指标测定结果表明AMDS对于结肠中的MPO、SOD、MDA及GSH-PX具有调节作用。AMDS能够抑制TNBS造成的MDA和MPO水平的升高,同时TNBS造模后降低的SOD及GSH-PX的活性经过AMDS治疗后也能升高。HE染色观察以及免疫组化的结果表明TNBS造成了大鼠结肠的炎症和损伤,而AMDS对炎症具有抑制作用,同时能修复损伤的结肠组织。同时免疫组化的结果也表明AMDS对于肠炎的治疗作用一部分机制可能是通过NF-κB信号通路进行调节,该结果和体外细胞实验结果相一致。AMDS保肝作用的初步体内研究由小鼠药物肝损伤模型的构建,常规肝损伤指标的评价以及保肝作用机制研究等部分组成。本文采用对乙酰氨基酚(APAP)构建急性肝损伤模型,考察了AMDS对小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、TNF-α和IL-6活性的影响；同时考察AMDS对肝组织中的MDA、SOD、谷胱甘肽(GSH)、GSH-PX和GSH/GSSG的水平,用组织病理切片考察肝损伤情况,用免疫组化法(IHC)观察肝细胞的炎症和脂质过氧化情况。结果发现,选择400mg/kg的剂量构建了APAP急性肝损伤模型,AMDS显著的抑制了血清中ALT、AST、LDH、TNF-α和IL-6活性升高；同时抑制了肝组织中MDA的升高和GSH及SOD、GSH-PX和GSH/GSSG的降低,减少了肝损伤。肝组织病理切片及免疫组化的实验结果显示AMDS具有较好的肝保护能力。AMDS的基本性质评价包括结构确证、体外含量分析方法的建立,溶解度、油水分配系数测定及稳定性考察。利用IR、1H-NMR、13C-NMR以及GC-MS对AMDS进行了结构确证,建立了相关的图谱。依据AMDS的紫外光谱特征,确定了AMDS的最大吸收波长,建立了测定含量的HPLC方法,方法学研究结果表明线性关系和专属性良好,回收率、精密度等符合要求。溶解度测定结果显示AMDS在水中的溶解度为26μg·mL-1,油水分配系数正辛醇-水中脂水分配系数1ogP为2.68,属于溶解度较低的脂溶性化合物。不同的增溶剂,会增加AMDS的溶解度,尤其以Tween80的增溶作用最强。稳定性考察结果表明,温度对于AMDS的稳定性有较大的影响,在低温条件下比较稳定,因此原料的贮存条件应为低温保存。当AMDS分散在不同溶剂中,加入抗氧剂会增加AMDS在室温条件下的稳定性。AMDS的固体化制剂研究评价了环糊精包合物、液固系统制剂和固体分散体三种剂型,研究重点是提高稳定性、掩盖气味、减少胃刺激性。结果表明,采用羟丙基-p-环糊精(HP-β-CD)以及磺丁基p-环糊精(SEB-β-CD)两种材料制备的包合物载药量和包封率都较p-环糊精(p-CD)低。因此选用β-CD作为包合材料,采用正交实验设计并对其制备工艺进行优化,得到最佳的制备包合物的工艺条件为β-CD:AMDS(w/w)的投料比为6：0.7,包合温度为40℃,包合时间为4h。采用IR、DSC和1H-NMR对包合物进行表征,结果表明包合成功。包合物稳定性的考察结果显示,制备的包合物大大增加了其稳定性。其次,采用液固制备技术制备了固体颗粒。对制备条件进行筛选,结果表明以PEG400为非挥发性的溶剂,以微晶纤维素：乳糖(1：1)为载体,以syloid(?) FP244为涂层材料,AMDS与PEG400比例为1：1,(微晶纤维素+乳糖)与syloid(?) FP244比例10：1时制备的固体剂型的流动性和载药因子较好。对制备的液固剂型进行稳定性考察,结果表明在30℃±2℃3个月时药物含量虽然有所降低,但与原药相比稳定性大大增加,长期稳定性实验结果表明低温条件贮存稳定。最后采用熔融法制备了AMDS的固体分散体,也提高了其稳定性。对三种固化剂型的肠溶胶囊溶出度进行测定,结果表明在3h药物基本能完全溶出。制备的三种固体形式可以用于其他制剂的制备。AMDS肠溶微丸制剂研究的重点包括素丸的制备和微丸包衣。肠溶微丸技术进一步提高了制剂的稳定性,降低了胃刺激性。首先考察两种不同的制备工艺制备微丸,结果表明采用空白丸芯载药的离心造粒制丸法载药量高、圆整度好。考察了不同粘合剂种类、药粉供给速度以及粘合剂的喷浆速度对微丸收率的影响,结果表明采用微晶纤维素为空白丸芯,3%的HMPC E5为粘合剂,药粉的供给速度为10～15 r/min,喷浆速度为5～10 r/min时,微丸的收率较高和圆整度较好。对药物微丸以Eudragit L30D-55水分散体为包衣材料进行包衣,包衣液处方中添加PEG6000改善膜的通透性,加入滑石粉减少微丸的粘连。以收率和体外释放度作评价指标,对微丸的肠溶包衣进行了优化。对制备的三批肠溶微丸进行体外释放度考察,结果表明在酸中累计释放率均小于7%,耐酸度良好,在pH6.8的缓冲溶液中AMDS在45 min累计释放率达到75%以上,表明制备工艺可靠,质量可行。肠溶微丸加速试验和长期试验结果显示微丸的性状、含量以及释放度均未发生明显的变化。AMDS制剂的生物药剂学研究包括主要代谢产物检测和代谢动力学研究组成。体内代谢研究结果发现AMDS在体内代谢很快,没有检测到药物原形,而是检测到两种主要的代谢产物AMSO和AMSO2。在多次给药后,进行药物代谢产物动力学分析发现,与油性分散剂相比,给予AMDS肠溶微丸后能使其代谢产物AMSO2在大鼠体内的Cmax和AUC0→∞分别提高至119%和173%,体内滞留时间MRT延长为134%,提示制备成微丸后可以延长AMSO2的代谢时间。本文首次通过体内、体外实验对AMDS对炎症性肠病的治疗作用及作用机制进行了初步研究,同时通过体内实验研究了AMDS对于药物引起的急性肝损伤的保护作用。结果表明AMDS不仅具有治疗炎症性肠病的作用而且具有保肝作用。将AMDS进行液体药物固体化,并进一步制备成肠溶微丸,能够掩蔽气味、减少胃刺激性、增加药物稳定性、提高治疗靶向性。本文的研究成果为AMDS的临床应用提供了一定的实验依据和理论基础。