【研究背景】皮肤屏障能抵御外界理化刺激、防止变应源及病原体等入侵,具有保护皮肤免受外界有害因素的作用,同时具有减少经皮水分丢失（Transepidermal Water Loss,TEWL）、承载触觉感受器及免疫监视等功能。其中细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）是皮肤屏障的重要结构成分,对维护皮肤屏障正常功能是不可或缺的。皮肤屏障通过多种方式减少TEWL,完成保湿功能。首先,角质层内细胞膜间交联形成不溶性外膜即角质包膜（cornified envelope,CE）,主要成分为神经酰胺（作为细胞外脂质的主要成分其他还有胆固醇、鞘磷脂）,在细胞间严密砌合从而限制水分的跨细胞流动。其次,皮肤蒸发的与汗腺分泌的水分混合表皮的皮脂及脂质形成水脂膜进一步减少表皮水分蒸发。此外,皮肤屏障含有多种有利于保湿的成分,包括天然保湿因子（Natural moisturizing factors,NMFs）、水通道蛋白（Aquaporins,AQPs）等。其中,ECM中的氨基酸、乳酸盐、尿素等NMFs成分因具有极强的水溶性而发挥保持水分的作用,半胱胺酸蛋白酶蛋白-14（Caspase-14）便是通过参与将丝聚蛋白（Filaggrin,FLG）降解的过程产生一些游离氨基酸类的NMFs,同时Casepase-14还可参与角质细胞激活角化的过程。另外,水通道蛋白3（Aquaporin 3,AQP3）是减少TEWL的重要屏障,兼具水分渗透作用及协助甘油运输,AQP3通过促进甘油转运参与脂质组成及代谢过程,也有助于皮肤屏障恢复和伤口愈合。皮肤依靠其“砖墙结构”式的皮肤屏障为机体提供机械屏障作用,屏蔽外界损伤刺激的作用,机体处在不断接触外界理化刺激损伤或病原体入侵的外界环境中,要求皮肤屏障具备持续的自我修复机制以及频繁触发的免疫应答功能,这需要皮肤屏障具有高度可塑性和信号提呈的能力,细胞外基质是实现这些功能的重要承担者。细胞外基质ECM具有高度动态性,是成纤维细胞通过分泌胶原前体和基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases,MMPs）完成合成、降解、重组和化学修饰等过程,不断重塑ECM的结果,ECM的重塑既包括结构成分的重排列,也包括炎症效应。其中,MMP-9又称明胶酶B,是MMPs中作用最大且最为复杂的一员,通过降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ型胶原等多种ECM成分产生胶原蛋白肽,而胶原蛋白肽可通过结合整联蛋白受体参与调节细胞增殖,迁移,凋亡和减少血管生成等多种细胞过程。此外,ECM中含有多种结构性糖蛋白,可充当细胞表面受体的配体来参与ECM与细胞的相互作用,也是一些生长因子的储存模式,这些生长因子与ECM结合,可以在蛋白水解后释放,例如Per一方面通过促进活化成纤维细胞分泌基质,收缩局部缺损皮肤以及硬化局部胶原纤维而达到促进创口愈合的作用;另一方面通过与αv整联蛋白结合来激活并刺激角质形成细胞（keratinocyte,KC）分泌可触发Th2反应的胸腺基质淋巴细胞生成素（Thymic stromal lymphopoietin,TSLP）,参与了皮肤屏障的修复及重塑中的炎症反应。另外,在皮肤屏障修复过程中,机体通过EGF和TGF-β调节Has2和Has3表达从而调控透明质酸（Hyaluronan,HA）的分泌,在皮肤创伤修复和炎症性皮肤病中促进KC的增殖和迁移而促进屏障修复,HA与表皮增殖,厚度和分化活动有关。外用糖皮质激素（Glucocorticoids,GCs）制剂是治疗过敏和变应性皮肤病的重要手段之一,但GCs的长期不规范使用可引起皮肤屏障破坏的一系列表现,如导致激素依赖性皮炎（Corticosteroid Addictive Dermatitis,CAD）,玫瑰痤疮样皮炎（Corticosteroid-Induced Rosacea-Like Dermatitis,CIRD）等皮质类固醇相关的皮炎,目前国外皮肤专著中尚未将激素依赖性皮炎作为独立疾病加以描述,而国内较多文献将外用GCs产生的副作用也归于CAD,本文中激素依赖性皮炎泛指长期外用激素引起的皮炎,涵盖了因长期超剂量、超疗程、超范围外用GCs引起的局部皮炎,其概念包括但不限于局部糖皮质激素戒断皮炎（Topical Corticosteroids Withdrawal Dermatitis）。已有研究提示,短期外用GCs可延迟皮肤渗透屏障的恢复,并提高角质层异常剥离发生率,长期局部使用GCs可抑制表皮的增殖和分化。临床发现,长期外用GCs可出现皮肤厚度变薄和弹性降低,毛细血管扩张和紫癜等症状,同时伴有不同程度的肿胀,瘙痒及灼热等GCs的戒断反应,导致激素依赖性皮炎。激素依赖性皮炎的发生机制尚未十分明确,GCs的积极抗炎作用被认为是通过糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor,GR）与炎症转录因子的直接相互作用,对转录因子的干扰来实现的,即转录抑制作用。另一方面,通过直接结合染色质的转录调控区快速且有效地增加了多个基因的表达发挥抗炎效应,即转录激活作用。如诱导的亮氨酸拉链（TSC22D3基因编码）抑制核因子-κB（NF-κB）和激活剂蛋白1（AP-1）;上调NF-κBa抑制剂（IκBa）从而抑制NF-κB。依赖GCs的转录抑制可与转录激活共存,其中转录激活可能是炎症基因最大程度和最有效的抑制方式,但也可能是激素治疗造成不利影响的主要原因。有研究发现,GCs通过抑制成纤维细胞增殖,减少ECM蛋白合成而影响皮肤屏障功能,包括抑制COL-1、COL-III表达,抑制白细胞介素（Interleukin,IL）-4/13诱导的Per表达（但不影响TGF-β诱导的Per生成）。此外,GCs还可抑制MMP1和MMP3的表达,抑制白介素-1α（IL-1α）对MMP-9的基因表达刺激从而影响细胞外基质的动态重塑。1,8-桉叶油（1,8-cineole,Cin）又名桉树脑或桉树油醇（Eucalyptol）,是桉叶油的主要有效成分,动物实验发现,Cin在小鼠肺炎中通过抑制MMP-9和核因子κB（Nuclear Factor Kappa-B,NF-κB）信号通路产生抗炎作用作用。有报道Cin可以保湿抗衰老、促进药物皮肤渗透、增强表皮抗菌能力等作用,但具体机制未见研究报道。此外,Cin还有抗微生物、抗炎、抗氧化等作用,近来随着Cin促进多种药物皮肤渗透作用及增强抗菌活性研究的不断深入,其在皮肤科的应用价值也引起我们的关注,尤其关于Cin在皮肤屏障修复方面的作用研究尚不多。加强Cin皮肤屏障作用研究对于开发利用这一植物药用资源有重要临床和经济价值。【目的】本研究以SD大鼠为研究对象,外用丙酸氯倍他索（Clobetasol Propionate,CP）为干预对照,外用桉叶油（Cin）为干预因素,通过正常皮肤和2,4-二硝基氯苯（2,4-Dinitrochlorobenzene,DNCB）诱导接触性皮炎基础上并外用0.05%CP为治疗及干预因素进一步诱发激素依赖性皮炎（Corticosteroid Addicitive Dermatitis,CAD）模型,利用q RT-PCR、Western blot和组织病理及免疫组化技术,探讨Cin对SD大鼠皮肤屏障功能相关蛋白CAP-14、FLG、AQP3、MMP-9、Per、HAS2和炎症相关物质TNF-α、NF-κB p65、IκBa的m RNA转录及蛋白表达水平,为探讨Cin对皮肤屏障保护作用提供理论依据。【方法】1、动物及外用制剂准备:在要求的屏障环境中持续提供全价营养颗粒饲料并体重相近且≥300g选取的SD大鼠,进行外用药物行为训练3天。2%戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉局麻后脱毛（剃毛）备皮,选定3cm×3cm实验区域。基质对照基质（酒精甘油搽剂）配置:30ml 75%酒精,添加甘油定容至100ml;Cin、CP外用剂型配置:所需体积的Cin,所需质量的CP溶于30ml 75%酒精,添加甘油定容至100ml。2、预实验:（1）通过免疫组化检测增殖性细胞核抗原（PCNA）确定外用Cin浓度为8%。（2）通过皮损评估确定0.05%CP CAD造模时间为20天。（3）依据文献,DNCB初次致敏浓度为7%,再次致敏浓度为0.1%可成功建立接触性皮炎模型。3、实验分组:设置正常皮肤组（Normal Skin,NS）和变应性接触性皮炎模型组（Allergic Contact Dermatitis,ACD）各组进一步分为以下治疗或干预组:3.1 NS组:NS-A组:基质对照组,酒精甘油搽剂,每天2次×20d;NS-B组:单纯CP组,0.05%CP搽剂,每天2次×20d;NS-C组:单纯Cin组,外用8%Cin搽剂,每天2次×20d;NS-D组:CP和Cin序贯干预组,CP每天2次×20d后,8%Cin每天2次×20d;NS-E组:Cin+CP混合组,8%Cin+0.05%CP复方搽剂,每天2次×20d;3.2ACD组:DNCB诱导CAD后开始0.05%CP治疗并诱导CAD ACD-A:基质对照组,酒精甘油搽剂,每天2次×20d;ACD-B:CP干预组,外用0.05%CP搽剂,每天2次×20d;ACD-C:Cin干预组,外用8%Cin搽剂,每天2次×20d;ACD-H:Cin+CP混合干预组,外用8%Cin+0.05%CP复方搽剂,每天2次×20d4、检测方法及指标:4.1观察指标4.1.1 SD大鼠搔抓频率（症状）评分规则（连续观察,统计每20分钟内的搔抓频率）:0分=无搔抓;1分=1次～2次;2分=3次～6次;3分=7次～10次;4分=11次～14次,5分=15次及以上。搔抓行为:同一动作的连续搔抓记为一次搔抓,如连续搔抓≥6秒记2次,仅计算前肢搔抓颈后、弯腰啃咬背部或后肢搔抓侧腹部等试图搔抓颈后实验区域的行为。4.1.2 SD大鼠皮损表现（体征）评分规则:红斑1分;水肿2分;丘疹脱屑3分,表皮变薄伴血管扩张3分;抓痕、糜烂4分。4.2、激素依赖性皮炎造模确认:符合下列条件:（1）NS组中:连续外搽0.05%CP过程中出现红斑、表皮变薄、血管扩张（毛细血管外露）等激素依赖性皮炎相关表现（2）NS组中:连续外搽0.05%CP后SD大鼠搔抓出现搔抓行为、烦躁不安,伴有皮肤抓痕等激素戒断反应（3）NS组中出现激素戒断反应但再次外用CP改善:经连续外搽0.05%CP 15天后,停药3天SD大鼠原搽药部位出现局部红斑加重,脱屑,搔抓行为等激素戒断反应,再次外用0.05%CP后症状改善。（4）模型干预组中:DNCB诱发的SD大鼠接触性皮炎,经过连续外搽0.05%CP后,原有皮炎表现消退,但继续每天持续外用0.05%CP后搔抓频发,伴有皮肤抓痕,停药后出现激素戒断反应,外用0.05%CP后改善,撤药后症状反复。4.3实验指标:采用免疫组化法使PNCA显色检测各Cin组KC的核分裂增殖活性。采用q RT-PCR检测各分组AQP3、FLG、Caspase-14、Per、MMP-9、HA、TNF-α、NF-κB p65、IκBa 10个基因m RNA转录水平,采用Western blot检测AQP3、Caspase-14、MMP-9、HAS2四种蛋白表达水平、采用免疫组化显色法检测NF-κB p65、IκBa蛋白的定位及表达水平。【结果】1、预实验:（1）Cin最佳实验浓度为8%;（2）外用激素20d后所有大鼠均出现外用激素的戒断现象,选择20天作为实验时长;（3）变应性接触性皮炎选择首次7%DNCN诱导,2周后0.1%DNCB激发。2、Cin对SD大鼠CAD症状体征改善作用:正常皮肤组:（1）单独外用Cin可减少CAD皮损及瘙痒症状;（2）Cin可缓解或延缓出现激素戒断反应,但不能改善外用激素引起的表皮萎缩、血管扩张。接触性皮炎模型组:（1）Cin具有抗炎及改善CAD皮损的作用;（2）与单独CP对比,CP+Cin共同作用可延缓或减轻毛细血管扩张及咬痕的发生。3、CAD模型实验组各干预因素对Caspase-14 m RNA转录和蛋白表达的影响:（1）NS CAD模型组:与基质组比较,Cin、CP、CP+Cin均显著上调Casepase-14m RNA的转录,分别上调56.5%、25.0%、31.6%,但CP下调Casepase-14蛋白的表达36.2%（均p＜0.05）。（2）ACD CAD模型组:与基质组比较,CP、CP+Cin均下调Casepase-14的m RNA转录,分别66.2%、86.6%,同时也下调蛋白表达,分别42.7%、56.0%（均p＜0.05）;Cin下调Casepase-14的蛋白表达46.3%（均p＜0.05）,而对m RNA转录无显著影响（p＞0.05）。4、CAD模型实验组各干预因素对FLG m RNA转录的影响:（1）NS组:与基质组比较,Cin上调了FLG m RNA的转录39.3%（均P＜0.05）;（2）ACD组:与基质组比较,CP及Cin+CP均下调了FLG m RNA的转录,分别85.2%、89.7%（均P＜0.05）。5、CAD模型实验组各干预因素对AQP3 m RNA转录和蛋白的影响:（1）NS组:与基质组比较,NS组CP、Cin、CP+Cin均显著上调AQP3蛋白的表达,分别54.5%、62.8%、95.4%（均P＜0.05）。（2）ACD组:与基质组比较,CP、Cin、CP+Cin均下调了AQP3 m RNA的转录,分别82.8%、71.2%、92.5%;但Cin、Cin+CP上调了AQP3的蛋白表达,分别51.2%、71.2%（均P＜0.05）,而CP同样上调AQP3蛋白表达20.0%,但不显著（p＞0.05）。6、CAD模型实验组各干预因素对MMP-9 m RNA转录和蛋白的影响:（1）NS组:与基质组比较,CP上调了MMP-9 m RNA的转录35.6%（均P＜0.05）,CP+Cin、CP后Cin干预均可显著上调MMP-9蛋白表达,分别87.4%、220.6%（p＜0.05）,而CP、Cin也上调了蛋白表达,分别34.8%、43.8%,但差异不显著（p＞0.05）。（2）ACD组:与基质组比较,CP下调了MMP-9 m RNA的转录66.2%,CP+Cin下调了MMP-9 m RNA的转录86.8%及蛋白表达13.2%（P＜0.05）,其中Cin同样上调了蛋白表达16.0%,但差异不显著（p＞0.05）。7、CAD模型实验组各干预因素对Per m RNA的影响:（1）NS组:与基质组比较,CP下调了Per m RNA的转录17.2%,而CP+Cin上调了Per m RNA的转录35.4%（均p＜0.05）,同时CP、Cin、CP后Cin、Cin+CP均上调Per蛋白表达,分别上调60.3%、28.4%、49.8%、35.0%（均P＜0.05）;（2）ACD组:与基质组比较,CP、CP+Cin均下调了Per RNA的转录,分别72.1%、44.6%,但外用CP、Cin、CP+Cin均上调Per蛋白表达,分别上调24.3%、234.1%、140.8%（均P＜0.05）。8、CAD模型实验组各干预因素对HA m RNA和HAS2蛋白的影响:（1）NS组:与基质组比较,Cin上调了HA m RNA的转录86.3%及蛋白表达60.9%,CP、CP+Cin均下调了HAS2蛋白的表达,分别37.3%、22.0%（P＜0.05）,CP后Cin干预组（NS-D）上调HAS2蛋白的表达130.2%（p＜0.05）。（2）ACD组:与基质组比较,CP、CP+Cin均显著下调HA m RNA转录,分别72.7%、44.6%,同时下调了蛋白的表达,分别91.0%、88.6%（均p＜0.05）。Cin下调了HAS2蛋白的表达83.2%（p＜0.05）。9、CAD模型实验组各干预因素对TNF-α、NF-κB p65、IκBa相关NF-κB通路的影响:（1）早期外用CP可能通过下调TNF-α、上调IκBa发挥抗炎作用,但长期外用CP可激活NF-κB通路介导炎症的持续发生。（2）Cin可能同时通过下调TNF-α、NF-κB p65转录、上调IκBa而发挥抗炎作用。（3）Cin可能抑制或缓解CP引起的NF-κB信号通路的激活。【结论】1、在SD大鼠正常皮肤以及DNCB诱导的SD大鼠接触性皮炎模型基础上,连续外用0.05%CP 20天均诱导出了SD大鼠激素依赖性皮炎。2、在正常的皮肤上Cin促进Cap-14、HAS2/HA的表达,可作为皮肤潜在保湿剂。此外,Cin可影响SD大鼠在不同皮肤状态上诱导出的激素依赖性皮炎中皮肤ECM中Casepase-14、AQP3、Periostin等3种皮肤屏障相关蛋白及TNF-ɑ、NF-κB、IκB等炎症物质的表达,及通过减少搔抓和减轻皮肤症状,有抗炎止痒功效,Cin和CP联合使用,可以延缓CAD的相关症状和体征的出现。3、Cin的抗炎止痒可能机制是通过下调TNF-α表达及调节NF-Κb/IκBa信号通路发挥抗炎效应。其屏障保护作用的详细机制还需进一步深入研究。