基因重复（gene duplication）是分子进化过程中产生新遗传物质的主要机制,能够为新功能基因的产生提供基本的物质和原材料基础,是一种重要的进化模式。基因重复事件可以增加基因组中基因的拷贝数,为基因提供发展出新功能的潜力,从而帮助物种在长期进化中适应不同的生态和环境变化。GroEL属于分子伴侣（molecular chaperone）中的伴侣素蛋白（chaperonin）家族,其作用广泛,通常在胞内帮助许多不同种类的蛋白进行折叠、成熟和转运,对于一些关键的生命过程是必不可少的。GroEL在发挥作用时通常需要辅伴侣蛋白GroES的协助,且二者都是热激蛋白,能够在高温胁迫条件下过量表达,更好地帮助细胞复性错误折叠的蛋白。在原核生物中,groEL重复现象广泛存在,然而目前相关研究主要针对单拷贝groEL的结构和功能等,对于多拷贝groELs的功能分化及调控机制等仍知之甚少。粘细菌（Myxobacteria）是一类革兰氏阴性细菌,具有复杂的多细胞群体行为特性、丰富的次级代谢产物合成能力以及广泛的环境适应性,被认为是研究细菌细胞识别与互作、细胞通讯、多细胞形态发生以及生命进化的重要模式生物材料。与其复杂的生活史特性相适应的是,粘细菌具有庞大的基因组和大量的重复基因,因此,对粘细菌重复基因的研究,有助于进一步了解功能分化的进化意义,阐明重复基因功能和表达所存在的关系,解析表达调控的分子机制,为人工定向改造基因、人为缩小基因组以降低宿主代谢负担以及多细胞群体行为的研究提供理论基础。本实验室前期在粘细菌模式菌株——黄色粘球菌DK1622中,探究了双拷贝groELs的细胞生理功能、功能分化及其分子机制。在核苷酸和氨基酸序列组成上,这两个groEL分别有83%和79%的同源性,但却在细胞生理功能上存在明显的功能分化:groEL1与菌株的发育有关,而groEL2对于细胞捕食和次级代谢产物myxovirescin的形成是必不可少的。对GroEL1和GroEL2的结构域置换结果证明,GroEL分子顶端结构域和C端赤道结构域的差异是决定两个分子底物选择性差异的主要原因。进一步的位点突变结果显示,GroEL1分子C-末端的6个GGM重复序列是GroEL1行使功能的必要片段。本文以黄色粘球菌DK1622为基本材料,在已有groELs相关的研究基础上,进一步研究了双拷贝groELs及单拷贝groES在功能和表达上的协同关系,揭示了双拷贝groELs转录差异的根本原因和分子调控机制,并鉴定到一个与groEL相关的新型调控因子,初步解释了其作用机制和存在意义。在黄色粘球菌DK1622基因组中存在双拷贝groEL和单拷贝groES基因,groaEL1（MXAN₄895）与其上游的groES（MXAN₄894）以操纵子形式存在,而groEL2（MXAN₄467）单独存在。我们在4861个完全测序的原核生物基因组中发现,19.5%的基因组中存在groEL重复现象,其中884个菌株具有双拷贝的groEL基因,且770个菌株中存在上游无相邻groES的groEL基因。目前还不清楚单独存在的groEL是否需要groES才能发挥作用,如果需要的话,双拷贝groEL和单拷贝groES基因又将如何平衡它们的表达水平。前期研究表明,黄色粘球菌DK1622可耐受双拷贝groELs中任一拷贝的失活,但二者不能被同时敲除。我们对于单拷贝groES的必要性也进行了分析,发现groES的存在是细胞存活所必需的。进一步的体内和体外依赖性分析实验证明了GroEL1和GroEL2在功能上都需要GroES的协助。在表达上,groEL1或groEL2的敲除不仅降低了groEL的表达,且降低了groES的表达,而groEL的异位回补则恢复了ggES和grSEL的表达。值得注意的是,当我们在groEL2基因前添加一个额外的groES基因以形成一个人工构建的groESL2操纵子时,对groES和groELs的表达几乎没有影响,但当我们通过自主复制质粒pZJY41使groES过表达时groEL又会显著上调。以上结果表明,黄色粘球菌DK1622可以协同调控双拷贝groELs和单拷贝groES的表达,促进了GroELs和GroES的功能协同。在双拷贝groELs和单拷贝groES具有协同功能和表达的基础上,我们进一步分析了其中存在的调控机制。通过不同生长时间点的q-PCR分析发现,黄色粘球菌DK1622中两个groEL基因的转录水平存在显著差异。我们首先证明了负调控因子HrcA和正调控因子σ32共同调节双拷贝groEEs的转录,hrcA和σ32的双重缺失可以消除两个groEL基因的转录差异。此外,我们还发现启动子区中的反向互补回文序列CIRCE元件（负调控蛋白HrcA的结合序列）与两个groEL基因的转录调控有关。groESL1的启动子区中存在两个CIRCE元件（CIRCE1groESL1和CIRCE2groEsL1）,而groEL2的启动子区只有一个CIRCE元件（CIRCEgroEL2）。在代表性细菌类群中,CIRCE元件的组成和位置通常都是保守的。进一步的体外结合实验表明,HrcA蛋白的结合倾向于CIRCE1groESL1,其次为CIRCEgroEL2,但其与CIRCE2groESL1不能结合。而碱基突变实验则显示,回文序列中的单碱基突变对HrcA与CIRCE元件的结合力有一定影响。最后,为了更直观的研究两个调控因子的作用,我们在大肠杆菌中构建了一个体内转录调控系统,将每个调控因子与不同的groEL启动子交叉配对。结果显示,HrcA和σ32的调控分别偏好于groEL2和groESL1的启动子区。基于启动子序列特征,我们在黄色粘球菌DK1622中提出了一种协同调控双拷贝groELs转录的基本模型。σ32蛋白能够与RNA聚合酶的核心酶结合,导致其结合在目的基因启动子区的-10区和-35区处,从而起始下游基因的转录;而HrcA则能够结合CIRCE元件从而抑制下游基因的转录。在黄色粘球菌DK1622中,HrcA蛋白与CIRCE1groESL1的结合力要强于CIRCEgroEL2,但不能结合CIRCE2groESL1,较强的CIRCE1groESL1分布在groESL1启动子的TSS和TLS之间,而CIRCEgroEL2位于groEL2的TSS上游且部分核苷酸与-35区重叠。对于groESL1的转录,HrcA和σ32结合在相应的识别序列上,HrcA与CIRCE1groESL1的结合影响了RNA聚合酶结合在启动子区域上从而阻止了转录,两种调控过程互不干扰。但对于groEL2的转录,HrcA和σ32竞争性地结合在启动子区域内,这可能在一定程度上削弱了σ32与启动子的结合能力,从而降低了σ32对groEL2的正调控作用。这种CIRCE位置上的差异导致了HrcA和σ32调控的偏好性,从而造成了双拷贝groEL基因的转录差异。而在热激条件下,尽管hrcA的转录上调,但HrcA蛋白不能完全复性,从而削弱了HrcA与CIRCE元件的结合能力。σ32的转录在热激下也会上调,这会引起更多的RNA聚合酶结合在启动子区,从而进一步上调双拷贝groELs的表达。即在热激条件下,双拷贝groELs的转录水平均明显高于正常条件下的转录水平,但也可以在HrcA和σ32的双重调控下达到一种动态平衡。在研究双拷贝groELs的调控机制时,我们还发现了一个CheY同源蛋白编码基因（MXAN₄468）对groES及两个groEL基因的转录有影响。该基因在黄色粘球菌DK1622基因组中恰好位于groEL2的上游并与之同向相邻,然而,我们已经证明二者不是共转录关系。此外,CheY同源蛋白编码基因在所有已测序的粘细菌中只存在于单独存在的groEL基因的上下游,而groESL的邻近基因中却不存在这类基因。在黄色粘球菌DK1622基因组的其他位置上,我们也发现了多拷贝的CheY同源蛋白编码基因,说明这一类基因可能比较重要且功能多样。通过一系列相关突变株的构建,我们发现MXAN₄468对groES及groEL1/2的转录均具有很强的负调控作用,而这种作用可能是通过HrcA蛋白来实现的。MXAN₄468对groEL2的转录有直接抑制作用,其基因下游区域很可能存在groEL2的负调控序列。进一步,在蛋白结构保守性分析上,我们发现MXAN₄468蛋白具有一个保守的磷酸化位点（61st,天冬氨酸）,作为双组分系统中的反应调节因子,MXAN₄468蛋白需要被组氨酸蛋白激酶磷酸化后才能够对groEEES及groEL1/2起到负调控作用或者发挥其它功能。总之,本文深入研究了双拷贝分子伴侣基因groELs的表达调控机制,以及其与单拷贝辅伴侣蛋白基因groES在功能和表达上的协同关系,并进行了新型调控因子的挖掘及其相关作用机制的初步探究。此外,我们推测双拷贝groEL基因的转录水平差异在基因重复的初期就已经产生了,早于功能分化出现的时间。转录水平差异可能帮助双拷贝groEL基因在基因组中留存下来,这是它们之后产生功能分化的前提。因此,我们认为关注重复基因的非编码区与关注重复基因本身同样重要,那些出现在重复基因之间非编码区的差异可能为编码区在序列和功能上的分歧提供了重要帮助。在具有众多重复基因的粘细菌中,groELs的转录水平显著高于其它重复拷贝,弄清二者的功能分化和调控机制以及存在的进化意义,为其它重复基因的研究提供了一定的理论基础和指导作用。