【摘 要】
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目的:探讨通过NF-κB寡脱氧核苷酸诱骗剂(NF-κB ODN Decoy)策略能否成功将正常大鼠骨髓来源单个核细胞构建成的耐受性树突状细胞(dendritic cell,DC),同时将该耐受性DC负载牛Ⅱ型胶原(bovine collagen typeⅡ,BⅡC),然后经尾静脉输入胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠体内,观察其对CIA大鼠T细胞亚
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目的:探讨通过NF-κB寡脱氧核苷酸诱骗剂(NF-κB ODN Decoy)策略能否成功将正常大鼠骨髓来源单个核细胞构建成的耐受性树突状细胞(dendritic cell,DC),同时将该耐受性DC负载牛Ⅱ型胶原(bovine collagen typeⅡ,BⅡC),然后经尾静脉输入胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠体内,观察其对CIA大鼠T细胞亚群的影响。方法:以180～200g雄性SD大鼠骨髓细胞用于培养DC,以180～200g雄性Wistar大鼠提取脾脏淋巴细胞,以160～180g雌性SD大鼠用于建立研究类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的CIA动物模型。1、细胞实验:(1)骨髓来源DC的培养:取骨髓分离出单个核细胞,加入大鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(cranulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)诱导成DC。(2)根据细胞处理方法分为4组:单纯培养DC组(control-DC组)、Decoy诱导DC组(Decoy-DC组)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激control-DC组(LPS-DC组)和LPS刺激Decoy-DC组(LPS-Decoy-DC组)。(3)观测指标:培养第8天时收集细胞经吉姆萨染色观察DC形态,培养当天和第8天台盼蓝染色观察细胞活力,流式细胞术检测DC细胞表面OX-62和CD80、CD86表达情况以判断DC的纯度和成熟度,混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte response,MLR)评估耐受性DC对T细胞的增殖能力的影响。2、动物实验:(1)建立CIA动物模型:第1天在SD雌性大鼠左足跖皮内注射200ml完全乳化的BⅡC进行初次免疫,第14天在该大鼠尾根部注射等量完全乳化的BⅡC进行再次免疫。(2)各组实验大鼠在初次免疫第20天进行尾静脉注射5×10~6个DC或0.5ml磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS),将实验大鼠分为4组:空白对照组、CIA模型组、正常大鼠BⅡC-Decoy DC对照组和CIA大鼠BⅡC-Decoy DC实验组。(3)观测指标:分别在初次免疫的1、7、14、21、28、35、42天观察大鼠关节肿胀情况并拍照、关节炎指数评分;取脾脏流式细胞术检测Th1(CD3~+CD8~-IFN-γ~+)、Th2(CD3~+CD8~-IL-4~+)、Th17(CD3~+CD8~-IL17~+)和Treg(CD3~+CD8~-Foxp3~+),分析脾脏CD4~+T细胞亚群的变化。结果:1、细胞实验:与对照组相比,经此方法培养8天的耐受性DC吉姆萨染色显示细胞表面毛发样突起粗且短;对照组和实验组提取当天和培养8天的DC经台盼蓝染色细胞活力均>95%,差异无统计学意义(P>0.05);流式细胞术显示各组DC表面OX-62均>95%,差异无统计学意义(P>0.05),然而与control-DC组相比,Decoy-DC组CD80和CD86阳性表达率和平均荧光强度明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与LPS-DC组相比,LPS-Decoy-DC组CD80和CD86阳性表达率和平均荧光强度明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与control-DC组相比,Decoy-DC组DC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与LPS-DC组相比,LPS-Decoy-DC组DC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。2、动物实验:与CIA模型组相比,CIA大鼠BⅡC-Decoy DC实验组大鼠在初次免疫28天左右关节肿胀程度开始降低,到42天时关节炎指数明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);流式细胞术检测Th1和Th17比率明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),而Th2和Treg比例明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:经NF-κB ODN诱骗剂加以细胞因子GM-CSF和IL-4可将骨髓来源单个核细胞诱导出具有一定稳定性的耐受性DC;负载有BⅡC的耐受型DC对CIA大鼠具有一定的干预效果,这种干预效果可能通过影响T细胞亚群使其向抑制炎症发展的方向调节从而起到缓解关节炎症状的作用。
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