目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内常见高发的恶性肿瘤之一,死亡率高,预后差,手术或介入治疗后易复发,目前药物治疗效果不理想,严重危害人们的健康。肝细胞癌的发生发展与肿瘤细胞异常增殖和分化密切相关。因此,进一步研究肝细胞癌发生发展的分子机制,探求有效的治疗措施具有重要意义。蛋白酶激活受体-2(proteinase-actived receptors2,PAR-2)是一种细胞膜表面受体,属于七次跨膜的G蛋白耦联受体超家族成员,广泛分布于哺乳动物体内多种组织和器官,可被胰蛋白酶、类胰蛋白酶、凝血因子Ⅶa和Xa等内源性激动剂激活,人工合成的小分子多肽SLIGKV-NH2也可模拟内源性激活剂的作用激活该受体。研究表明,在多种肿瘤组织及细胞中存在PAR-2的高表达,提示PAR-2可能与肿瘤的生物学特性和恶性程度密切相关。前期工作中,我们的研究发现肝癌组织中PAR-2的表达较癌旁组织明显升高,关于PAR-2对HCC细胞增殖的影响及其分子机制,目前尚不清楚。本试验通过体外培养人肝细胞癌细胞株HepG2,研究胰蛋白酶和SLIGKV-NHz对肝癌细胞增殖的影响,并探讨其调节作用的可能分子机制。　　 方法:采用免疫细胞化学染色法、免疫荧光法检测HepG2细胞PAR-2的表达与定位情况。分别利用胰蛋白酶、PAR-2激动肽SLIGKV-NH2、反PAR-2激动肽VKGILS-NH2、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、MEK(ERK1/2的上游)的特异性抑制剂PD98059干预细胞生长,细胞计数并绘制细胞生长曲线;MTT法检测对细胞增殖能力的影响;流式细胞术(FCM)检测细胞周期改变情况;Fura-2荧光法检测HepG2细胞[ca2+]I变化;RT-PCR法检测PAR-2、TAT-2、c-fos、c-jun、c-myc、CyclinD1及PCNA mRNA表达变化;Western blot法检测PAR-2、ERK1/2、p-ERK1/2、c-fos、c-jun、c-myc、CyclinD1及PCNA蛋白表达变化。　　 结果:　　 PAR-2在肝细胞癌细胞HepG2中的表达与定位　　 1免疫细胞化学法检测PAR-2的表达与定位:结果显示HepG2细胞与抗PAR-2多克隆抗体具有较强的结合反应,PAR-2抗原表现为棕黄色,着色主要在胞膜和胞浆中。　　 2免疫荧光化学法检测PAR-2的表达与定位:结果显示HepG2细胞经FITC染色后,在激光共聚焦显微镜下观察发现呈绿色荧光染色,着色主要在胞膜和胞浆中。　　 PAR-2激动剂对肝细胞癌细胞HepG2增殖的影响　　 1.MTT法检测不同浓度PAR-2激动剂对肝癌细胞增殖的影响:结果显示SLIGKV-NH2在1-50μmol/L、胰蛋白酶在1-25 nmol/L时均能促进肝细胞癌细胞HepG2增殖,且呈浓度依赖性(P＜0.01或P＜0.05)。SLIGKV-NH2在100μmol/L、胰蛋白酶在50 nmol/L时,肝癌细胞增殖能力分别较SLIGKV-NH2在50μmol/L、胰蛋白酶在25 nmol/L时有所下降(P＜0.01)。而50μmol/L VKGILS-NH2对细胞增殖能力的影响不明显,与对照组相比差异无显著意义(P＞0.05)。　　 2.细胞计数并绘制生长曲线:通过生长曲线可以发现,在0-48 h时间范围内,50μmol/L SLIGKV-NH2、25 nmol/L胰蛋白酶组的细胞数与对照组比较差异有显著意义(P＜0.01),随着时间的增加,差异越明显(P＜0.05)。而50μmol/L VKGILS-NH2组与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 PAR-2激动剂对肝癌HepG2细胞PAR-2 mRNA及蛋白表达的影响1 RT-PCR法检测PAR-2 mRNA的表达:结果显示分别用25 nmol/L胰蛋白酶、50μmol/L SLIGKV-NH2处理细胞后,PAR-2 mRNA表达量分别为0.99±0.01,0.70±0.01(以β-actin为参照的相对灰度),对照组PAR-2mRNA表达量为0.35±0.01,胰蛋白酶或SLIGKV-NH2组与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01)。而50μmol/L VKGILS-NH2组PAR-2 mRNA表达量为0.34±0.01,与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 2.Western blot法检测PAR-2蛋白的表达:结果显示分别用25 nmol/L胰蛋白酶、50μmol/L SLIGKV-NH2处理细胞后,PAR-2蛋白表达量分别为3.025±0.049,2.632±0.031(以β-actin为参照的相对灰度),对照组PAR-2蛋白表达量为1.954±0.038,胰蛋白酶或SLIGKV-NH2组与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01)。而50μmol/L VKGILS-NH2组PAR-2蛋白表达量为1.922±0.032,与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 PAR-2激动剂对肝癌HepG2细胞TAT-2表达的影响　　 1.MTT法检测SBTI对肝细胞癌细胞HepG2生长的抑制作用:结果显示SBTI能明显抑制HepG2细胞增殖,且呈剂量依赖性。0.05,0.5,2.5,5,25 g/L SBTI处理细胞24 h后细胞抑制率分别为:6.72％、19.92%、33.55%、49.00%,75.82%,以上各组细胞抑制率与正常对照组比较均有显著差异(P＜0.01),其IC50值为5.07g/L。　　 2RT-PCR法检测PAR-2激动剂单独/联合SBTI对TAT-2 mRNA表达的影响:结果显示50μmaol/L SLIGKV-NH2或25 nmol/L胰蛋白酶刺激细胞后,TAT-2 mRNA表达明显上调(P＜0.001)。分别用2.5,5 g/L SBTI预处理细胞能显著抑制胰蛋白酶诱导的TAT-2 mRNA表达的上调(P＜0.001)。50μmol/L VKGILS-NH2组与对照组相比差异无显著性(P＞0.05)。　　 PAR-2激动剂对HepG2细胞Ca2+通路的影响　　 Fura-2荧光法检测肝细胞癌细胞[Ca2+]I变化:结果显示25 nmol/L胰蛋白酶、50μmol/L SLIGKV-NH2刺激HepG2细胞2 min时[Ca2+]I迅速升高,与对照组比较差异有显著意义(P＜0.01),随后在2 min内逐渐下降,最后降至基线水平,而50μmaol/L VKGILS-NH2对HepG2细胞[Ca2+]i的影响不明显,与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 ERK1/2通路参与PAR-2激动剂对肝癌细胞增殖的调节1 Western blot法检测PAR-2激动剂处理可使肝癌细胞ERK1/2通路激活:结果显示50μmol/L SLIGKV-NH2或25 nmol/L胰蛋白酶刺激细胞后,P-ERK1/2蛋白表达明显上调(P＜0.001),而ERK1/2的表达变化不明显(P＞0.05)。用PD98059预处理细胞能显著抑制胰蛋白酶或SLIGKV-NH2诱导的p-ERK1/2蛋白表达的上调(P＜0.001)。而50μmol/LVKGILS-NH2组与对照组相比差异无显著性(P＞0.05)。　　 2.PD98059阻断ERK1/2通路对HepG2细胞增殖的影响　　 (1).MTT法检测PD98059对肝细胞癌细胞HepG2生长的抑制作用:结果显示PD98059能明显抑制HepG2细胞的增殖,并且呈剂量依赖性。5,10,20,50,100μmol/L PD98059处理细胞24 h后细胞抑制率分别为:4.27%、13.37%、26.33%、50.47%、67.72%,以上各组细胞抑制率与正常对照组比较均有显著差异(P＜0.01),其IC50值为50.36μmol/L。这表明,PD98059对人肝癌HepG2细胞增殖具有较强的抑制作用,且呈剂量依赖性,其最有效药物浓度为50.36μmol/L。　　 (2).MTT法检测阻断ERK1/2通路对HepG2细胞增殖的影响:结果显示SLIGKV-NH2在50μmol/L、胰蛋白酶在25 nmol/L时均能促进肝癌细胞增殖(P＜0.001),而50μmol/L VKGILS-NH2对细胞增殖能力的影响不明显,与对照组相比差异无显著意义(P＞0.05)。用50μmol/L PD98059预处理细胞能显著抑制胰蛋白酶或SLIGKV-NH2诱导的细胞增殖(P＜0.001)。　　 (3).流式细胞术检测肝癌HepG2细胞周期变化:结果显示50μmol/LSLIGKV-NH2和25 nmol/L胰蛋白酶组G0/G1期细胞的百分比降低,而S期、G2/M期细胞百分比和细胞增殖指数(PI)N显增加,与对照组相比差异有显著性(P＜0.01),而50μmol/L VKGILS-NH2组与对照组相比差异无显著性(P＞0.05)。用50μmol/L PD98059预处理细胞能显著抑制胰蛋白酶或SLIGKV-NH2诱导的上述效应(P＜0.01)。　　 3.阻断ERK1/2通路对c-fos、c-jun、c-myc、CyclinD1及PCNA表达的影响　　 (1).RT-PCR法检测阻断ERK1/2磷酸化对PAR-2介导的c-fos、c-jun、c-myc、CyclinD1及PCNA mRNA表达的影响:结果显示50μmol/LSLIGKV-NH2或25 nmol/L胰蛋白酶刺激细胞后,c-fos、c-jun、c-myc、CyclinD1及PCNAmRNA表达明显上调(P＜0.001)。用50μmol/L PD98059预处理细胞能显著抑制胰蛋白酶或SLIGKV-NH2诱导的c-fos、c-jun、c-myc、CyclinD1及PCNA mRNA表达的上调(P＜0.001)。而50μmol/LVKGILS-NH2组与对照组相比差异无显著性(P＞0.05)。　　 (2).Western blot法检测阻断ERK1/2磷酸化对PAR-2介导的c-fos、c-jun、c-myc、CyclinD1及PCNA蛋白表达的影响:结果显示50μmol/LSLIGKV-NH2或25 nmol/L胰蛋白酶刺激细胞后,c-fos、c-jun、c-myc、CyclinD1及PCNA蛋白表达明显上调(P＜0.001),用PD98059预处理细胞能显著抑制胰蛋白酶或SLIGKV-NH2诱导的c-fos、c-jun、c-myc、CyclinD1及PCNA蛋白表达的上调(P＜0.001)。而50μmol/L VKGILS-NH2组与对照组相比差异无显著性(P＞0.05)。　　 结论:　　 1.肝细胞癌细胞HepG2在基因及蛋白水平均表达PAR-2;　　 2.胰蛋白酶和SLIGKV-NH2可通过激活PAR-2促进肝细胞癌HepG2细胞增殖,呈时间-剂量依赖性,提示胰蛋白酶和PAR-2与HCC的增殖密切相关;　　 3.胰蛋白酶激活PAR-2后可能通过形成一个相互作用的自分泌环路增强HCC增殖;　　 4.胰蛋白酶和SLIGKV-NH2激活PAR-2后可能通过PAR-2-Ca2+通路促进HCC增殖;　　 5.胰蛋白酶和SLIGKV-NH2激活PAR-2后可能通过PAR-2-MEK-ERK1/2通路促进HCC增殖,加速细胞周期进程。