黄连(Rhizoma Coptidis)具有清热燥湿,泻火解毒等功效,在临床上应用广泛。黄连同样具有广泛的抗肿瘤活性,但对于其抗肿瘤活性研究以小檗碱为主,其他成分涉及较少。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,简称线虫)是一种在土壤中生存、以微生物和腐烂生物碎片为食,易于繁殖的小型整体模式生物,具有很多药物筛选优势。let-60(n1046gf)突变体是线虫中LET-60蛋白(RAS同源蛋白)13位发生突变(G>A)所形成的功能获得性突变体,造成通路异常激活而具有Muv表型,所以抑制该通路活性将会抑制Muv表型,从而筛选出Ras蛋白抑制剂。本课题组通过线虫let-60(nl046gf)模型,建立了完整的筛选系统,并筛选出中药黄连水提物具有较好的抑制线虫表型活性,分析了黄连化学成分,探讨黄连不同组分、黄连不同炮制品的活性及生物碱含量测定,并分析其与活性差异的关系,另一方面通过Ras点突变细胞初步探讨黄连碱抗肿瘤活性机理,为黄连抗肿瘤临床应用研究奠定基础。一、基于线虫let-60(n1046gf)的中药抗肿瘤组分筛选基于线虫let-60(n1046gf)模型建立了中药提取物活性的筛选系统,采用固体培养基的筛选方式对线虫let-60(n1046gf)进行给药。选取20味中药,用70%乙醇制备提取物,通过结果分析,黄连提取物对let-60(n1 046gf)的Muv表型有明显的抑制作用。当给药浓度达到0.5 mg/mL时,与对照组相比,线虫的Muv%显著减少,且其Vulva(类似于产卵器的假组织)个数也相应减少。二、黄连成分的定性分析应用HPLC-MS技术对黄连提取物的主要生物碱类成分进行鉴别,并对其裂解规律进行了分析,主要鉴别出木兰花碱、格陵兰黄连碱、四氢碎叶紫堇碱、四氢黄连碱、药根碱、表小檗碱、非洲防己碱、小檗红碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、甲基黄连碱12种生物碱成分。采用HPLC-MS法,在分析单糖PMP衍生化的质谱裂解规律的基础上,快速识别黄连多糖中的单糖组成,并解析其衍生物的裂解规律。通过分析,得到的黄连多糖中含有甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖/木糖、岩藻糖,其中核糖、岩藻糖为首次在黄连多糖中报道的单糖。表明了糖类衍生物在所建立的质谱条件下呈现专一性,且醛酸类和非醛酸类单糖均符合该裂解规律。三、黄连不同部位、不同炮制品的含量测定及抗肿瘤活性评价利用大孔树脂的洗脱吸附原理,对黄连提取物进行分离,用水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇以及90%乙醇梯度洗脱,将黄连提取物分为6个组分,利用HPLC对不同组分进行含量测定。将黄连炮制为5种不同的炮制品,黄连生品、酒黄连、萸黄连、姜黄连、清炒黄连,利用HPLC对不同炮制品进行含量测定。将黄连粗分为3个组分,生物碱、非生物碱以及多糖,当黄连生物碱和非生物碱给药浓度均达到1 mg/mL时,黄连非生物碱成分对于线虫let-60(n1046gf)的Muv表型没有改变,黄连生物碱成分对于线虫Muv表型有轻微的抑制作用,但抑制作用远不及黄连粗提物。黄连多糖对线虫let-60(n1 046gf)的Muv表型也没有明显的影响。将分离得到的6个黄连组分给药线虫let-60(n1 046gf),统计各个组分在线虫模型上的活性差异。实验结果发现,当各组分给药浓度达到0.25 mg/mL时,组分10%和组分30%可以显著降低线虫的Muv表型比例,其它组分均没有明显的效果,因此推测黄连中的有效成分在这两个组分中含量最高。将黄连不同炮制品给药线虫let-60(n1 046gf),统计在线虫模型上的活性差异,实验结果发现其炮制品均可抑制线虫Muv表型比例,且萸黄连和清炒黄连作用稍弱于黄连生品水提物。通过主成分分析的方法,发现黄连提取物的生物活性与所检测的6种化合物相关,其相关系数相差不大,推测可能是这6种生物碱甚至更多其他未检测成分综合作用的结果。四、黄连碱对PANC-1细胞的活性作用及机制初步探讨利用2个Ras点突变癌细胞模型PANC-1和LoVo细胞,检测黄连中7个主要单体的细胞增殖抑制率。经过筛选两种Ras蛋白点突变细胞株,结果显示黄连碱对PANC-1细胞具有较好的活性,其IC50值为100 μM。故接下来将对黄连碱对PANC-1细胞抑制活性机制进行探讨。对给药后的细胞进行划痕实验,初步检测细胞给药前后迁移速率的变化,实验结果显示,给药后细胞的划痕修复能力较对照组明显减弱,且随着给药浓度的增大,作用越明显,呈剂量依赖性。进行Hoechest染色实验,检测给药后细胞核凋亡形态学的影响,实验结果显示,黄连碱对PANC-1细胞的细胞形态并没有影响,只是抑制了细胞增殖。通过应用流式细胞仪,应用PI法检测给药后对细胞周期的影响,实验发现,黄连碱可明显阻滞细胞G0/G1期,且呈现剂量依赖性。应用western blotting检测化合物对Ras/MAPK信号通路下游相关蛋白Mek、Erk蛋白的影响,检测Ras/MAPK信号通路发现,Mek、Erk磷酸化的相对水平均没有变化,但是Erk总蛋白及Erk蛋白磷酸化水平的绝对值都有减少,说明黄连碱可能通过降低Erk原型及磷酸化两种蛋白,从而抑制Ras/MAPK下游信号通路的持续激活,发挥其抗肿瘤功效。