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目的和意义微波(300MHz-300GHz)在人类社会各重要领域发挥着愈来愈关键的作用,随之而来的健康危害备受关注。脑是微波辐射最为敏感的靶器官。研究表明,微波辐射可引起海马神经元突触可塑性损伤,但其机制尚不明确。microRNA-30a(miR-30a)是本课题组发现的微波辐射后大鼠海马组织中差异表达的非编码RNA,有报道其下调可增强Beclin1介导的细胞自噬并减轻缺血性脑损伤。然迄今,miR-30a与神经细胞自噬的关系及其在微波辐射后突触可塑性损伤中的作用研究尚属空白。因此,本研究旨在揭示miR-30a对自噬的调控在微波辐射致突触可塑性损伤中的作用,为阐明微波辐射脑损伤的分子机制、探寻生物标志物和防治靶点奠定基础。材料与方法一、微波辐射致大鼠海马突触可塑性损伤模型中miR-30a的变化规律及其靶基因研究将110只二级雄性Wistar大鼠随机分为假辐射组和辐射组,采用30mW/cm~2的微波源辐射15min,隔日一次,共三次。于辐射后7d、14d、1m和2m,采用Real-time PCR和原位杂交检测大鼠海马组织miR-30a表达和分布;采用miRDB、miRWalk、miRanda和TargetScan 4个数据库预测miR-30a靶基因,并通过KEGG数据库对预测靶基因进行功能富集分析;采用双荧光素酶报告基因实验确定miR-30a与其靶基因AMPK(Prkaa2)的相互作用;采用Western Blot检测miR-30a靶基因AMPK(Prkaa2)表达。二、微波辐射对PC12细胞突触可塑性损伤中自噬、miR-30a及其靶基因AMPK的影响研究采用30mW/cm~2微波辐射NGF诱导的PC12细胞15min,于辐射后1h、6h、12h和24h,采用扫描电子显微镜观察细胞形态结构,采用HPLC检测氨基酸类神经递质释放;采用透射电子显微镜观察细胞自噬形态结构,采用Western Blot检测自噬标志物Beclin1和LC3-II/I表达(经浓度为50μmol/L氯喹预处理);采用Real-time PCR检测miR-30a,采用Western Blot检测miR-30a靶基因AMPK(Prkaa2)表达。三、miR-30a干预对微波辐射后PC12细胞突触可塑性、自噬及其AMPK的影响研究采用miR-30a mimic构建miR-30a过表达及其对照的PC12细胞模型,采用30mW/cm~2微波辐射,于辐射后6h,采用扫描电子显微镜观察PC12细胞形态结构;采用Western Blot检测自噬标志物Beclin1和LC3-II/I(经浓度为50μmol/L氯喹预处理)以及miR-30a靶基因AMPK(Prkaa2)的表达。实验结果一、大鼠海马组织miR-30a表达水平和分布变化与假辐射组相比,辐射组大鼠海马组织miR-30a于辐射后7d、14d和1m表达显著下降(P<0.01)。假辐射组大鼠海马组织miR-30a于海马DG区锥体细胞胞浆和胞核呈阳性表达,辐射后7d和14d,辐射组大鼠海马组织miR-30a于DG区锥体细胞胞浆和部分胞核呈弱阳性表达,其IOD和MOD均明显减少(P<0.01或P<0.05)。二、miR-30a靶基因预测和验证结果miR-30a靶基因主要涉及11个信号通路(P<0.05),包括谷氨酸能突触通路、Apelin信号通路、叉形头转录因子的O亚型信号通路、细胞衰老通路、环磷酸鸟苷-蛋白激酶G信号通路、后叶催产素信号通路、血清素激活突触通路、糖尿病并发症中晚期糖基化终末产物及其受体信号通路、查格斯病(美国锥虫病)通路、自噬通路、细胞活素-细胞活素受体交互作用通路等;其中与自噬相关的靶基因有8个(P<0.01),包括Atg12、Ddit4、Pik3r2、Gabarapl2、AMPK(Prkaa2)、Irs1、Beclin1和Rras2等。miR-30a mimic组野生型AMPK(Prkaa2)荧光素酶活性显著下降(P<0.01),证实AMPK(Prkaa2)是miR-30a的靶基因。三、大鼠海马组织miR-30a靶基因AMPK(Prkaa2)改变与假辐射组相比,辐射组于辐射后14d、1m和2m海马组织AMPK(Prkaa2)表达明显上调(P<0.01)。四、PC12细胞突起形态和氨基酸类神经递质的改变假辐射组PC12细胞突起修长、细胞连接丰富且交织呈网状;辐射组PC12细胞于辐射后1h突起变短、连接减少,辐射后6h突起和连接显著减少甚至断裂,辐射后24h细胞连接消失。辐射后1h和6h,PC12细胞抑制性氨基酸类递质GABA释放显著上升(P<0.01),兴奋性氨基酸类递质Glu释放显著下降(P<0.01),Glu/GABA比值显著减少(P<0.01)。五、PC12细胞自噬形态及其标志物Beclin1和LC3-II/I改变假辐射组仅见少量溶酶体,辐射组于辐射后6h可见大量自噬体和溶酶体,辐射后24h见数个自噬体和溶酶体。与假辐射组相比,辐射组Beclin1表达于辐射后6h显著上调(P<0.01)。未经氯喹处理时,辐射组PC12细胞LC3-II/I比值于辐射后6h、12h和24h未见明显改变;经氯喹预处理后,LC3-II/I比值于辐射后6h和12h显著升高(P<0.01)。六、PC12细胞miR-30a及其靶基因AMPK(Prkaa2)的改变与假辐射组相比,辐射组miR-30a表达于辐射后6h显著降低(P<0.01)、AMPK(Prkaa2)表达于辐射后12h、24h明显上调(P<0.01或P<0.05)。七、miR-30a过表达后PC12细胞突起改变加入mimic组的PC12细胞中,miR-30a于微波辐射后6h显著增加(P<0.01);假辐射miR-30a阴性对照组,突起修长,连接丰富且交织呈网状;假辐射miR-30a过表达组,突起较长,连接较丰富;30mW/cm2微波辐射miR-30a阴性对照组,突触缩短或减少;30mW/cm2微波辐射miR-30a过表达组,突触缩短或减少甚至断裂,细胞间几乎无连接。八、miR-30a过表达后PC12细胞自噬标志物的改变经30mW/cm~2微波辐射后,过表达miR-30a组PC12细胞Beclin1表达于辐射后6h显著降低(P<0.01),氯喹预处理后的过表达miR-30a组LC3-II/I比值于辐射后6h显著降低(P<0.01)。九、miR-30a过表达后PC12细胞miR-30a靶基因AMPK(Prkaa2)的改变经30mW/cm~2微波辐射后,过表达miR-30a组PC12细胞AMPK(Prkaa2)表达于辐射后6h显著降低(P<0.01)。结论一、30mW/cm~2微波辐射可致大鼠海马组织miR-30a表达下调、分布减少。二、miR-30a靶基因涉及的信号通路有谷氨酸能突触通路、Apelin信号通路、叉形头转录因子的O亚型信号通路、细胞衰老通路、环磷酸鸟苷-蛋白激酶G信号通路、后叶催产素信号通路、血清素激活突触通路、糖尿病并发症中晚期糖基化终末产物及其受体信号通路、查格斯兵(美国锥虫病)通路、自噬通路以及细胞活素-细胞活素受体交互作用通路等11个;其中与自噬相关的靶基因有Atg12、Ddit4、Pik3r2、Gabarapl2、AMPK(Prkaa2)、Irs1、Beclin1和Rras2等8个。三、经双荧光素酶报告基因实验确认,AMPK(Prkaa2)是miR-30a的靶基因;30mW/cm~2微波辐射可致大鼠海马组织miR-30a靶基因AMPK(Prkaa2)表达上调。四、30mW/cm~2微波辐射可引起PC12细胞:(1)突触结构可塑性损伤,表现为突起长度缩短或数量减少,细胞之间连接减少或消失;突触功能可塑性损伤,表现为细胞氨基酸类神经递质释放异常。(2)自噬激活,表现为自噬小体、自噬溶酶体增多,自噬标志物Beclin1和LC3-II/I比值升高。(3)miR-30a减少,其靶基因AMPK(Prkaa2)表达上调。五、miR-30a过表达导致30mW/cm~2微波辐射后PC12细胞突触可塑性损伤加重、细胞表面突起缩短断裂和减少,自噬抑制、自噬标志物表达降低,miR-30a靶基因AMPK(Prkaa2)表达降低;miR-30a可通过抑制靶基因AMPK(Prkaa2)表达,抑制微波辐射致神经细胞自噬、加重微波辐射致突触可塑性损伤。