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第一部分RNAi介导的NAMPT基因表达抑制对C57BL/6J小鼠糖脂代谢及胰岛素抵抗的影响目的探讨NAMPT基因表达抑制对C57BL/6J小鼠糖脂代谢及胰岛素抵抗的影响。方法40只健康雄性的C57BL/6J小鼠,鼠龄7周,适应性喂养1周,随机分为普食喂养组(NF组,n=10),高脂喂养组(HF组,n=10);高脂+pAd-GFP组(GFP组,n=10),高脂+pAd-shNAMPT组(shNAMPT组,n=10),均喂养12周。于11W末分别给予GFP和shNAMPT组小鼠尾静脉注射pAd-GFP或pAd-shNAMPT。3d后行颈动静脉导管置入术,术后各组小鼠适应性喂养3天。采用扩展高胰岛素正葡萄糖钳夹术(示踪剂为3-3H标志的葡萄糖)评价糖脂代谢及胰岛素抵抗变化。结果HF组、GFP组和shNAMPT组肝脏组织NAMPT mRNA和蛋白表达及血浆NAMPT蛋白表达均较NF组明显降低(均P<0.01),且shNAMPT组肝脏组织NAMPT mRNA和蛋白表达及血浆NAMPT蛋白表达明显低于HF组和GFP组(均P<0.01)。三组高脂喂养的C57BL/6J小鼠体重、空腹血糖(FBG)、血浆胰岛素(Fins)、血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、和肝脏TC、 TG水平均明显高于NF组,(均P<0.01),而shNAMPT组与HF组和GFP组比较,HDL-C和Fins水平增高(P<0.05或P<0.01),肝脏TC明显降低(P<0.05)。钳夹稳态时,shNAMPT组HDL-C虽被抑制,但仍明显高于NF组、HF组和GFP组(均P<0.01)。在相同的高胰岛素输注下,NF组的葡萄糖输注率(GIR)明显高于HF组、GFP组和shNAMPT组(均P<0.01),shNAMPT组的GIR与HF组和GFP组相比虽轻度降低,但差异无统计学意义。钳夹结束时,三组高脂喂养小鼠的葡萄糖清除率(GRd)明显低于NF组(均P<0.01),而肝糖输出率(HGP)明显高于NF组(均P<0.01);shNAMPT组的GRd轻度低于HF组和GFP组,其HGP轻度高于HF组和GFP组,但均无统计学意义(均P>0.05)。结论高脂饮食喂养C57BL/6J小鼠可诱导类似人类T2DM生理特点的胰岛素抵抗模型。NAMPT基因抑制对高脂诱导C57BL/6J小鼠产生的胰岛素抵抗无影响。第二部分RNAi介导的NAMPT基因表达抑制对动脉粥样硬化的影响及机制研究第一节NAMPT基因表达抑制对ApoE-/-小鼠脂代谢和动脉粥样硬化的影响目的探讨NAMPT基因表达抑制对ApoE-/-小鼠脂代谢及动脉粥样硬化的影响方法48只雄性的ApoE-/-小鼠,鼠龄7周,适应性喂养1周,随机分为高脂喂养+PBS组(PBS组,n=10),高脂+pAd-GFP组(GFP-A组,n=10)和高脂+pAd-shNAMPT组(NAMPT-A组,n=10),均喂养12周。PBS组、GFP-A组和NAMPT-A组于高脂喂养的第8周末和10周末分别给予尾静脉注射PBS、Ad-GFP或Ad-shNAMPT。RT-PCR和western blot检测NAMPT的基因及蛋白表达。酶法检测各组小鼠血脂和肝脏脂质。用HE检测小鼠主动脉窦部的斑块面积;用油红O和天狼星红苦味酸染色分别检测小鼠主动脉窦部斑块中的脂质和胶原含量;用油红O染色法检测小鼠降主动脉的中性脂肪含量。结果NAMPT-A组肝脏组织NAMPTmRNA和蛋白表达水平及血浆NAMPT蛋白表达均明显低于PBS组和GFP-A组(均P<0.01)。NAMPT-A组血浆HDL-C水平明显高于PBS组和GFP-A组,而肝脏组织的TC低于PBS组和GFP-A组(均P<0.01或P<0.05)。与PBS组和GFP-A组相比,NAMPT-A组主动脉窦部的斑块面积和中性脂肪含量明显降低,而斑块中的胶原含量明显升高(均P<0.01)。NAMPT-A组降主动脉的中性脂肪含量明显低于PBS组和GFP-A组(均P<0.01)。结论NAMPT基因表达抑制能明显减少斑块面积,增加斑块纤维化,使斑块趋于更稳定的表型。NAMPT基因表达抑制可能具有抗动脉粥样硬化的作用。第二节NAMPT基因表达抑制对ApoE-/-小鼠巨噬细胞胆固醇逆转运的体内研究目的探讨NAMPT基因表达抑制对ApoE-/-小鼠巨噬细胞胆固醇逆转运的影响及机制研究方法24只雄性的ApoE-/-小鼠,鼠龄7周,适应性喂养1周,随机分为高脂喂养+PBS组(PBS组,n=8),高脂+pAd-shGFP组(GFP-A组,n=8)和高脂+pAd-shNAMPT组(NAMPT-A组,n=16),均喂养12周。PBS组、GFP-A组和NAMPT-A组于高脂喂养的第8周末和10周末分别给予尾静脉注射PBS、Ad-GFP或Ad-shNAMPT。于第12周腹腔注射经ac-LDL和3H-cholesterol处理过的RAW264.7巨噬细胞悬液(0.5ml/鼠,细胞数达4.5×106,放射活性6.4×106cpm)。快速蛋白液相色谱法分离血浆脂蛋白及酶法检测胆固醇含量。液体闪烁计数法测定小鼠血浆、肝组织及粪便的3H含量。RT-PCR和western blot检测肝脏的NAMPT、PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1的基因及蛋白表达。结果FPLC及酶法分析显示NAMPT-A组小鼠血浆HDL(峰值26-31)中的胆固醇含量高于PBS组和GFP-A组。NAMPT-A组小鼠6h、24h及48h血浆3H含量较PBS组和GFP-A组显著增多,占注射总量的百分比分别为(6h1.46±0.36VS1.11±0.22,1.10±0.23),(24h5.01±0.83VS3.5±0.44,3.55±0.62),(48h5.26±0.95VS3.79±0.75,3.81±0.88),(P<0.05或P<0.01)。NAMPT-A组小鼠肝脏3H含量较PBS组和GFP-A组显著增多(6.88±0.79VS3.88±0.72,3.92±0.73),(均P<0.05),粪便的3H含量显著增多(9.85±2.01VS6.29±1.26,6.31±1.32),(均P<0.05)。与PBS组和GFP-A组相比,NAMPT-A组小鼠肝脏的PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1基因和蛋白表达均明显升高(均P<0.01)。结论NAMPT基因表达抑制可能通过上调肝脏PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1基因的表达,促进小鼠体内巨噬细胞胆固醇逆向转运。第三节MK866介导的NAMPT基因表达抑制对细胞胆固醇流出的分子机制研究目的探讨NAMPT基因表达抑制对小鼠巨噬细胞胆固醇流出的影响及机制研究方法(1)用Ad-GFP或Ad-shNAMPT干预3H-cholesterol标记的巨噬细胞,然后用含有HDL的培养基孵育,LSC法测定细胞胆固醇流出;(2)以Ad-GFP或Ad-shNAMPT干预RAW巨噬细胞和Hepa1-6肝细胞,然后用MK866(PPARα抑制剂)干预。酶法测定细胞内的TC含量。RT-PCR和western blot检测两种细胞NAMPT、PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1的基因和蛋白表达。结果1.与Ad-GFP相比,Ad-shNAMPT干预后巨噬细胞和肝脏细胞NAMPT基因及蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。2.Ad-shNAMPT干预明显促进体外培养巨噬细胞的胆固醇流出(P<0.01)。3.与Ad-GFP相比,Ad-shNAMPT干预降低RAW和Hepa1-6细胞内TC含量,MK866抑制这种效应(均P<0.05);与Ad-GFP相比,Ad-shNAMPT干预升高RAW和Hepa1-6细胞的PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1基因和蛋白表达,而这种效应能被MK866抑制(P<0.05或P<0.01)。结论NAMPT基因表达抑制可能通过激活PPARα-LXRα-ABCA1/ABCG1通路,促进小鼠巨噬细胞胆固醇流出和降低细胞内的TC含量。