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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,俗称“猪蓝耳病”,是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍和各年龄阶段猪呼吸系统疾病为主要症状的高度接触性传染病。该病以引起免疫抑制、病毒持续性感染和继发感染为主要特征,是影响全球养猪业健康发展的重要疫病之一。P-Body（m RNA processing body,P-Body）是细胞质内不具有包膜结构的m RNA-蛋白亚细胞复合体,主要对m RNA进行监视、质量控制、降解,同时参与完成基因沉默、翻译抑制、天然免疫过程等细胞重要活动,具有功能多样性。APOBEC3F/3G属于载脂蛋白B m RNA编辑酶催化多肽样蛋白（apolipoprotein B m RNA editing enzyme catalytic polypeptide,APOBECs）家族成员,定位于P-Body,具有胞苷脱氨酶活性,是重要的宿主限制因子,据报道其对多种病毒增殖具有抑制作用。目前PRRSV增殖过程对P-Body组件分子的动态变化影响、APOBEC3F/3G对PRRSV增殖是否具有抑制作用均未见报道。因此,本研究以PRRSV、P-Body、APOBEC3F/3G为研究对象,探究PRRSV增殖过程对P-Body组件分子的影响、APOBEC3F对PRRSV增殖是否具有抑制作用、IFNγ是否可通过增加APOBEC3G超表达来对影响PRRSV的增殖,试验结果为研究PRRSV与宿主抗病毒天然免疫间的关系拓宽思路,也为研发新型抗病毒蛋白药物提供理论基础。主要研究内容如下:1.与PRRSV增殖相关的P-Body组件分子筛选:根据Gene Bank数据库中已公布的P-Body组件分子基因序列,设计42对P-Body组件分子特异性引物,采用q-PCR方法在m RNA水平分析感染PRRSV 24h后的Marc145细胞中P-Body组件分子转录水平动态变化。结果显示:APOBEC3F、APOBEC3G、Ago2、Ccr4-Not、DCP1a、DCP1b、DCP2、EDC3、EDC4、GW182、HNRNPU、LSM2、LSM3、LSM4、LSM6、DHX9、MOV10、PUM1、RAP55、SMG7、STAU2、SYNCRIP、UPF3A,23个分子m RNA水平下调;DDX6、LSM1、PUM2,3个分子m RNA水平上调;DDX3X、ILF3、LSM5、LSM7、SMG1、SMG5、SMG6、Ro52、TNRC6B、TNRC6C、TTP、TUT4、UPF1、UPF2、UPF3B、XRN1,16个分子没有显著变化。结果表明PRRSV感染会影响P-Body大部分组件分子转录水平的变化。2.APOBEC3F/3G基因克隆及生物信息学分析:利用分子生物学方法从猴源Marc145细胞分别扩增出APOBEC3F（m A3F）、APOBEC3G（m A3G）基因的CDS区,苏太猪源外周血单个核细胞扩增出APOBEC3F（p A3F）基因的CDS区,并进行克隆和测序分析;采用在线生物学软件对不同宿主源A3F/3G基因进行生物学信息分析。结果显示:m A3F、m A3G CDS分别为1122bp、1152bp,p A3F CDS为1257 bp,均与预期大小相符;m A3F基因与猕猴（Gen Bank登录号:KX583651）核苷酸和氨基酸序列相似性最高,分别为96.5%、93.0%;p A3F与野猪（Gen Bank登录号:EU871586）核苷酸和氨基酸序列相似性最高,分别为99.0%、98.8%;而m A3F与p A3F的核苷酸、氨基酸序列同源性仅为56.2%、36.9%,A3F基因存在种属差异;m A3F、p A3F基因在生物体内不能稳定存在,而m A3G基因能稳定存在。m A3F、p A3F、m A3G蛋白均具有APOBECs家族成员特有Pfam APOBEC＿N CD1、Pfam APOBEC＿C CD2结构域。m A3F、p A3F、m A3G蛋白二级、三级结构主要包括无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠,不具有跨膜结构和信号肽,具有多个糖基化、磷酸化修饰位点。3.APOBEC3F对PRRSV增殖的影响:构建真核重组表达质粒pc DNA 3.1-Flagm A3F、pc DNA 3.1-Flag-p A3F,分别转染不同剂量pc DNA 3.1-Flag-m A3F、pc DNA 3.1-Flag-p A3F于Marc145细胞,24 h后感染PRRSV,36 h后收集样品,采用IFA方法检测重组蛋白Flag-m A3F、Flag-p A3F在细胞中的表达,q-PCR和Western blot方法分别检测过表达m A3F与p A3F对PRRSV增殖的影响。分别转染不同剂量A3F干扰片段于Marc145细胞,24 h后感染PRRSV,36 h后收集样品,采用q-PCR和Western blot检测干扰内源性A3F对PRRSV增殖的影响。结果显示:m A3F蛋白主要定位于细胞质、p A3F定位于细胞核和细胞质;过表达m A3F或p A3F后PRRSV的N基因转录水平与翻译水平明显下调,干扰内源性m A3F后PRRSV的N基因转录水平与翻译水平明显上调。结果表明m A3F、p A3F可显著抑制PRRSV的增殖,且呈现剂量依赖性。4.IFNγ对APOBEC3G抗PRRSV作用的影响:构建真核重组表达质粒pc DNA3.1-Flag-m A3G,分别转染不同剂量pc DNA 3.1-Flag-m A3G于Marc145细胞,24 h后感染PRRSV,36 h后收集样品,采用IFA检测重组蛋白Flag-m A3G在细胞中的表达,q-PCR和Western blot分别检测过表达m A3G对PRRSV增殖的影响;分别设置4个组:空载体、IFNγ、pc DNA3.1-Flag-m A3G、pc DNA 3.1-Flag-m A3G+IFNγ,分别转染于Marc145细胞,24 h后加IFNγ处理,24 h后感染PRRSV,36 h后收集样品,采用q-PCR和Western blot分别检测IFNγ是否可以增加m A3G超表达来影响PRRSV的增殖,且依赖JAK-STAT信号通路途径。结果显示:m A3G蛋白主要定位于细胞核和细胞质;过表达m A3G后PRRSV的N基因转录水平与翻译水平明显下调;IFNγ+pc DNA3.1-m A3G处理组JAK1、JAK2、SATA1 m RNA水平显著上调,IFNGR1、IFNGR2 m RNA水平没有显著变化;pc DNA3.1-m A3G处理组JAK1、JAK2、SATA1 m RNA水平没有显著变化,IFNGR1、IFNGR2m RNA水平显著上调;IFNγ+pc DNA3.1-m A3G处理组相对pc DNA3.1-m A3G处理组m A3G基因转录水平与翻译水平明显上调,PRRSV的N基因转录水平与翻译水平明显下调。结果表明A3G可显著抑制PRRSV的增殖,且呈现剂量依赖性;IFNγ可促进A3G超表达来抑制PRRSV增殖,且可能依赖于JAK-STAT信号通路途。