论文部分内容阅读
中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是我国重要的甲壳类水产经济物种,其生长与蜕壳过程密切相关,养殖在同一环境下的中华绒螯蟹蜕壳增重率不一致,导致商品蟹大小不一,严重影响中华绒螯蟹的产量和经济效益。本研究针对养殖过程中中华绒螯蟹蜕壳后增重差异的生物学问题,通过中华绒螯蟹一个完整蜕壳周期的养殖,以获得不同增重率的中华绒螯蟹个体;并以增重率差异显著的两组中华绒螯蟹为研究对象,采用多组学技术相结合的方法,辅以相应的分子功能验证,探究中华绒螯蟹蜕壳增重差异的调控机制。主要研究结果如下:1.不同蜕壳时期调控中华绒螯蟹增重率差异的机制探究不同蜕壳时期对中华绒螯蟹蜕壳后增重所起的作用是否存在差异,现不得而知。本章研究兼顾蜕壳这一生物学现象对中华绒螯蟹增重的直接调控,初步探讨了整个蜕壳周期（间期、前期和后期）内基因-代谢网络对中华绒螯蟹增重的调控。在一个完整的蜕壳周期中,分别采集所有中华绒螯蟹个体在蜕壳间期（InM）、蜕壳前期（PrM）和蜕壳后期（PoM）的血淋巴样本,筛选蜕壳后增重率差异显著的两组（高增重率组和低增重率组）样本进行生化指标测定、代谢组和转录组测序分析。血浆生化指标测定结果显示:高增重率组葡萄糖含量在PrM时期显著上升并高于低增重率组（P＜0.05）;高增重率组5-HT含量在InM时期显著高于低增重率组（P＜0.05）。通过代谢组和转录组整合分析,筛选出两个蜕壳增重率差异组在三个蜕壳时期中的关键差异代谢物（DMs）和差异表达基因(DEGs及特定的代谢通路,初步提出了不同蜕壳时期调控中华绒螯蟹蜕壳后体重增长的组学分子机制。在InM,高增重率组富集在核苷酸代谢、色氨酸/苯丙氨酸/赖氨酸代谢、氧化磷酸化、TCA循环、内质网蛋白加工、核糖体和谷胱甘肽代谢等代谢途径;在PrM,高增重率组富集在色氨酸/苯丙氨酸代谢、突出囊泡循坏、氧化磷酸化和谷胱甘肽代谢等代谢途径;在PoM,高增重率组富集在色氨酸/苯丙氨酸代谢、脂肪酸降解和谷胱甘肽代谢等代谢途径。结果表明:生长快速的中华绒螯蟹具有活跃的细胞内蛋白生物合成能力、较高的抗氧化和解毒能力以及较强的神经内分泌系统调节能力。这些特征可能对调控蜕壳周期内中华绒螯蟹的快速增重具有重要作用,为探究中华绒螯蟹蜕壳周期内调控体重增长的分子和代谢机制提供了初步证据。2.蜕壳间期调控中华绒螯蟹增重率差异的机制探究为深入解析中华绒螯蟹蜕壳后增重率差异的分子调控机制,选取与生长密切相关的肌肉和肝胰腺组织进行基因表达模式分析并挖掘功能候选基因。本章进行新一轮的中华绒螯蟹饲养,同样通过一个完整的蜕壳周期（2次蜕壳）,在第2次蜕壳后15天（InM）采集肌肉和肝胰腺组织,筛选出增重率差异显著的两组样本进行转录组测序分析,比较分析蜕壳间期不同增重率组的基因表达特征。结果显示:在肌肉组织中,高增重率组上调表达基因主要富集在肌肉发育相关的代谢过程,下调表达基因主要富集在N-糖基化等过程;DEGs涉及肌动蛋白（Actin1）、肌球蛋白重链（MYH）、微管蛋白（TUB）、早期生长反应因子1（EGR1）、生长阻滞特异基因1（GAS1）,激活素ⅡB型受体（ActRⅡB）等基因。在肝胰腺组织中,高增重率组上调表达基因主要富集在氧化磷酸化等代谢途径,下调表达基因主要富集在脂肪酸降解、氨基酸分解等相关过程;DEGs涉及脂肪酸结合蛋白（FABP1）、脂肪酸延长酶（FAE）、乙酰CoA硫酯酶（ACOT1）、ATP合成酶（ATPase）、细胞色素氧化酶（COX3）、NADH脱氢酶（NADH5）等基因。血浆中葡萄糖含量结果显示不同增重率组不存在显著差异（P＞0.05）,5-HT浓度结果显示高增重率组显著高于低增重率组（P＜0.05）。研究表明高增重率中华绒螯蟹通过加速肌肉蛋白合成促进蜕壳间期的肌肉生长,在肝胰腺内则通过加快脂类合成为下一次蜕壳积累能量外,并通过氧化分解葡萄糖为提供肌肉生长所需的大量能量,从而实现对蜕壳后快速增重的调控。3.Es-ActRⅡB基因调控中华绒螯蟹蜕壳生长的分子功能研究激活素ⅡB型受体（ActRⅡB）作为转化生长因子-β（TGF-β）超家族的丝氨酸/苏氨酸激酶受体,参与脊椎动物肌肉生长和脂类代谢的调节。本章研究以中华绒螯蟹ActRⅡB作为生长候选基因,对其进行了分子结构分析及其参与蜕壳增重的功能验证。（1）利用RACE技术克隆获得Es-ActRⅡB基因cDNA全长4,916 bp,开放阅读框1,683 bp,编码560个氨基酸,预测蛋白结构域包含一个胞外的激活素受体结构域和一个胞内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,在TGF-β家族受体中高度保守。（2）利用qRT-PCR技术检测了Es-ActRⅡB在4个不同蜕壳时期（PoM、InM、PrM和E）的11个不同组织中的表达,Es-ActRⅡB mRNA在4个蜕壳时期均在肝胰腺中表达量最高,在肌肉中表达量最低,且都在蜕壳前期相对表达量达到最高（P＜0.05）。（3）进一步利用dsRNA干扰技术敲降Es-ActRⅡB基因的表达,通过持续干扰中华绒螯蟹幼蟹的一个完整蜕壳周期,评估了干扰Es-ActRⅡB后对中华绒螯蟹生长特性的影响,分析了肌肉和肝胰腺组织中氨基酸和脂肪酸成分的变化,并检测了相关基因的表达变化。结果显示:与对照组相比,RNA干扰（RNAi）组蜕壳后的增重率和特定生长率均显著高于对照组（P＜0.05）,肝胰脏指数却显著降低（P＜0.05）;同时,RNAi组肌肉和肝胰腺组织中水解氨基酸（TEAA、TNEAA和TAA）含量均显著升高,饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量略有上升,但不存在显著性差异（P＞0.05）,肝胰腺组织中多不饱和脂肪酸含量显著降低（P＜0.05）。此外,ActRⅡB信号通路5个相关基因的mRNA表达显示,RNAi组激活素I型受体（ActRI）和插叉头框蛋白O（FoxO）在肝胰腺和肌肉中显著下调表达（P＜0.05）,而SMD3、SMAD4和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表达无显著变化（P＞0.05）;3个脂类代谢相关基因的mRNA表达显示,RNAi组肉碱棕榈酰转移酶1β（CPT1β）、脂肪酸合成酶（FAS）和脂肪酸延长酶（FAE）在肌肉和肝胰腺组织中均显著下调表达,除了CPT1β在肌肉中上调表达（P＜0.05）。研究表明,Es-ActRⅡB是一种结构与功能保守的生长抑制因子,抑制ActRⅡB信号通路通过影响蛋白质合成和脂质代谢,正向调控中华绒螯蟹的肌肉生长。4.不同增重率中华绒螯蟹的肠道微生物组成差异为探究肠道微生物与中华绒螯蟹增重率差异之间的关系,本章研究利用16S rDNA测序分析了处于蜕壳间期的不同增重率中华绒螯蟹的肠道微生物组成结构和功能差异。结果显示:中华绒螯蟹肠道微生物主要由厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门组成;高增重率组的肠道微生物丰富度（Ace指数）显著高于低增重率组（P＜0.05）,但两者的肠道微生物多样性（Shannon和Simpson指数）不存在显著差异（P＞0.05）;在门分类水平下,不同增重率组肠道微生物组成不存在显著性差异（P＞0.05）,但高增重率组存在特有的低丰度螺旋体门和酸杆菌门;在属分类水平下,高增重率组中黄杆菌属、norankf Kineosporiaceae和酸微菌纲的CL500-29marinegroup显著高于低增重率组（P＜0.05）,并且存在双歧杆菌属、瘤胃球菌属等56个特有菌属;PICRUSt功能预测分析发现,高增重率组肠道碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂质代谢和能量代谢相关的微生物丰度高于低增重率组。研究表明不同增重率中华绒螯蟹肠道微生物的组成结构存在一定的差异,增重率高组中华绒螯蟹肠道微生物存在特有的双歧杆菌属等有益菌属,可促进中华绒螯蟹的体重增长。