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长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs,LncRNAs)在人类正常生理及病理过程中均发挥重要作用,包括肿瘤。已经有研究证实ZNF667-AS1基因在宫颈癌中低表达,在乳腺癌中呈现异常高甲基化,而ZNF667-AS1基因在食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的调控机制及与ZNF667基因的关系在国内外尚未见报道。本研究检测了ZNF667-AS1基因在食管鳞癌中的表达情况及甲基化状态,分析了其表达及甲基化状态与患者临床病理资料的关系,探讨了其启动子区甲基化状态对基因转录的影响,检测了ZNF667-AS1基因的细胞定位。进一步通过过表达ZNF667-AS1基因,研究了其对食管癌细胞体外增殖、迁移、侵袭能力的影响及其生物学机制。同时研究了ZNF667基因在食管鳞癌中的表达、甲基化水平及其与患者临床病理资料之间的关系,并探讨ZNF667-AS1与ZNF667基因在食管鳞癌中的相关性。主要研究内容和结果如下:第一部分长链非编码RNA ZNF667-AS1与ZNF667基因在食管癌细胞系及食管鳞癌组织中的表达及相关性目的:分别研究ZNF667-AS1及ZNF667基因在食管癌细胞系及食管鳞癌组织中的表达及相关性,分析其表达水平与患者临床病理资料间的关系。方法:1.应用实时荧光定量反转录多聚核苷酸酶链式反应(Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)的方法检测ZNF667-AS1和ZNF667基因在4株食管癌细胞系(Kyse170、Eca109、TE1、TE13)以及54例食管鳞癌及其相应癌旁正常组织中的表达水平。2.应用Paris试剂盒分离食管癌细胞系(Kyse170、Eca109、TE1、TE13)的胞核和胞浆,应用qRT-PCR的方法检测ZNF667-AS1基因的核浆分布情况。结果:1.ZNF667-AS1基因在食管癌细胞系中的表达情况:ZNF667-AS1基因在食管癌细胞系(Kyse170、Eca109、TE1、TE13)中表达均低于正常对照组(P<0.05)。2.ZNF667-AS1基因在食管癌细胞系中的核浆分布情况:ZNF667-AS1基因在食管癌细胞系(Kyse170、Eca109、TE1、TE13)中主要定位于细胞核。3.ZNF667基因在食管癌细胞系中的表达情况:ZNF667基因在食管癌细胞系(Kyse170、Eca109、TE1、TE13)中表达均低于正常对照组(P<0.05)。4.ZNF667-AS1基因在食管鳞癌及其相应癌旁正常组织中的表达情况:食管鳞癌组织中ZNF667-AS1基因的表达显著低于其相应癌旁正常组织(P<0.05),并且与淋巴结转移、分化程度和TNM分期密切相关(P<0.05)。5.ZNF667基因在食管鳞癌及其相应癌旁正常组织中的mRNA表达情况:食管鳞癌组织中ZNF667基因的mRNA表达显著低于其相应癌旁正常组织(P<0.05),并且与淋巴结转移、分化程度和TNM分期密切相关(P<0.05)。6.食管鳞癌组织中ZNF667-AS1与ZNF667基因的mRNA表达相关性:在食管鳞癌组织中ZNF667-AS1与ZNF667基因的mRNA表达之间呈现明显正相关(P<0.05)。第二部分长链非编码RNA ZNF667-AS1与ZNF667基因在食管鳞癌中的甲基化状态及机制研究目的:研究食管癌细胞系及食管鳞癌组织中ZNF667-AS1基因与ZNF667基因CpG岛各区域的甲基化状态,分析其甲基化状态对于基因转录的影响以及与患者临床病理资料间的关系。方法:1.应用qRT-PCR的方法检测ZNF667-AS1及ZNF667基因在食管癌细胞系(Kyse170、Eca109、TE1、TE13)中5-Aza-dC处理前后表达水平的变化。2.应用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation specific polymerase chain reaction,MSP)的方法检测5-Aza-dC处理前后4株食管癌细胞系(Kyse170、Eca109、TE1、TE13)、54例食管鳞癌及其相应癌旁正常组织中ZNF667-AS1与ZNF667基因CpG岛各区域的甲基化状态。3.应用双荧光素酶报告基因(Dual-luciferase reporter assay system)系统检测ZNF667-AS1与ZNF667基因CpG岛各区域的甲基化状态对于基因启动子区转录活性的影响。结果:1.ZNF667-AS1和ZNF667基因在5-Aza-dC处理前后食管癌细胞系中的表达情况:在5-Aza-dC处理后的4株食管癌细胞系中,ZNF667-AS1和ZNF667基因表达均升高(P<0.05)。2.ZNF667-AS1与ZNF667基因在食管癌细胞系中的甲基化状态:在5-Aza-dC处理后的4株食管癌细胞系中,ZNF667-AS1与ZNF667基因CpG岛各区域甲基化程度均降低。3.ZNF667-AS1与ZNF667基因在食管鳞癌及其相应癌旁正常组织中的甲基化状态:食管鳞癌组织中,ZNF667-AS1与ZNF667基因CpG岛各区域甲基化率均高于其相应癌旁正常组织(P<0.05),与组织分化和TNM分期相关(P<0.05)。4.ZNF667-AS1和ZNF667基因在食管鳞癌组织中的表达与其CpG岛各区域甲基化状态之间的关系:ZNF667-AS1和ZNF667在发生区域二甲基化的食管鳞癌组织中的表达水平低于该区域未发生甲基化的食管鳞癌组织(P<0.05),而区域一和区域三的甲基化状态与ZNF667-AS1和ZNF667在食管鳞癌组织中的表达无明显差异(P>0.05)。5.ZNF667-AS1基因在食管癌细胞系中的甲基化状态对基因转录活性的影响:近端启动子区和远端CpG岛发生甲基化可抑制基因转录(P<0.05),第一外显子区甲基化状态对基因转录影响不明显(P>0.05)。第三部分长链非编码RNA ZNF667-AS1对食管癌细胞生物学行为的影响及机制研究目的:研究过表达ZNF667-AS1基因对食管癌细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的影响及机制。方法:1.构建过表达载体pcDNA3.1-ZNF667-AS1,并转染Eca109细胞系,并通过qRT-PCR的方法验证转染效率。2.采用MTS及克隆形成实验测定过表达ZNF667-AS1基因对食管癌细胞体外增殖能力的影响。3.采用Transwell小室迁移实验测定过表达ZNF667-AS1基因对食管癌细胞体外迁移能力的影响。4.采用Transwell小室侵袭实验测定过表达ZNF667-AS1基因对食管癌细胞体外侵袭能力的影响。5.应用qRT-PCR的方法检测过表达ZNF667-AS1基因对ZNF667基因mRNA表达水平的影响。6.应用qRT-PCR的方法检测过表达ZNF667-AS1基因对EMT相关基因(E-cadherin、Snail、Vimentin、Zeb1以及Twist1)表达水平的影响。结果:1.过表达ZNF667-AS1基因细胞株的构建与验证:构建ZNF667-AS1过表达载体pcDNA3.1-ZNF667-AS1,并转染Eca109细胞系后,应用qRT-PCR的方法检测发现,转染组ZNF667-AS1的相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。2.过表达ZNF667-AS1基因对食管癌细胞体外增殖能力的影响:MTS及克隆形成实验结果显示,过表达ZNF667-AS1基因可抑制Eca109细胞的体外增殖活性(P<0.05)。3.过表达ZNF667-AS1基因对食管癌细胞体外迁移能力的影响:Transwell小室迁移实验结果显示,过表达ZNF667-AS1基因可抑制Eca109细胞体外迁移能力(P<0.05)。4.过表达ZNF667-AS1基因对食管癌细胞体外侵袭能力的影响:Transwell小室侵袭实验结果显示,过表达ZNF667-AS1基因可抑制Eca109细胞体外侵袭能力(P<0.05)。5.过表达ZNF667-AS1基因对ZNF667基因mRNA表达水平的影响:qRT-PCR结果显示,在ZNF667-AS1过表达的Eca109细胞中,ZNF667基因mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。6.过表达ZNF667-AS1基因对EMT相关基因的影响:qRT-PCR结果显示,在ZNF667-AS1过表达的Eca109细胞中,E-cadherin的mRNA表达量显著上调(P<0.05),Snail、Vimentin、Zeb1和Twist1的mRNA表达量显著下调(P<0.05)。结论:1.ZNF667-AS1和ZNF667基因在食管癌细胞和食管鳞癌组织中表达较低,并与食管鳞癌的发生和发展密切相关。2.食管鳞癌中ZNF667-AS1和ZNF667基因启动子区呈现高甲基化状态,其中近端启动子区异常高甲基化状态可能是导致其表达缺失的机制之一。3.过表达ZNF667-AS1基因可显著抑制食管癌细胞的体外生物学功能,且可能通过调控EMT相关基因的表达而发挥作用。