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N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)是所有高等真核生物信使RNA(mRNA)上最丰富的内部转录后修饰,可参与调节mRNA加工和代谢过程,包括mRNA的翻译和稳定性,mRNA从核的输出,核保留和剪接等。m6A修饰过程是一个动态可逆的过程,由甲基转移酶(“Writer”编码器)和去甲基酶(“Eraser"”消码器)共同调控。目前在哺乳动物中发现的甲基转移酶复合体的主要成分包括METTL14、METTL3、WTAP以及KIAA1429,去甲基酶包括FTO和ALKBH5。另外,m6A修饰位点可由结合蛋白(“Reader”读码器)YTHDF1-3、YTHDC1、HNRNPA2B1等识别。尽管在哺乳动物中阐明mRNA m6A甲基化机制方面取得了进展,但是关于它们在植物中的相关知识大部分是未知的。本文从棉花中分离鉴定了 6个m6A“writer”基因,研究了它们的表达、编码的蛋白的互作模式及其在棉花中的功能。此外,也分析了拟南芥中KIAA1429的同源蛋白VIR的功能。获得的主要结果概述如下:1.棉花m6A writer蛋白的鉴定和进化关系分析根据已经公布的四倍体陆地棉基因组数据库,我们在棉花基因组中分离鉴定了6个假定的编码RNA 甲基转移酶的基因,其中3个来自 A基因组,3个来自D基因组,分别命名为GhMTA-A/D,GhMTB-A/D和GhFIP37-A/D。系统进化分析显示,GhMTA-A/D,GhMTB-A/D和GhFIP37-A/D蛋白与可可的亲缘关系较近。2.棉花MTA、MTB以及FIP37基因的表达模式分析RNA-seq数据显示GhFIP37-A/D、GhMTA-A/D 以及 GhMTB-A/D基因在棉花雌蕊和花瓣中优势表达,在雄蕊中的表达相对较低。而在纤维发育的不同阶段中,GhFIP37-A/D、GhMTA-A/D以及GhMTB-A/D 在纤维起始阶段(-3DPA 胚珠-3DPA胚珠)表达相对较高。同时,我们利用qRT-PCR技术对这些基因在棉花中的表达模式进行了验证。结果显示,GhMTA、GhMTB及GhFIP37在棉花各个组织及纤维发育的各个阶段中皆有表达,且都在主茎顶芽中的表达般高,暗示着这些基因很可能参与调控棉花茎顶端分生组织的发育。在棉花纤维发育过程中,qRT-PCR结果与RNA-seq数据一致,均显示GhMTA、GhMTB及GhFIP37在纤维起始期的表达相对较高,开花后10-15天纤维中(纤维快速伸长期)的表达较低,推测这些基因的表达可能与纤维伸长负相关。3.棉花MTA、MTB以及FIP37蛋白的亚细胞定位分析我们构建了 GMTA-D::eGFP,GhMTB-A::eGFP 和 GhFIP37-A::eGFP 融合表达载体,通过烟草瞬时表达体系,使用共聚焦显微镜观察烟草叶片下表皮细胞,结果显示绿色荧光信号呈散点状分布,且与DAPI信号重合,说明GhMTA、GhMTB及GhFIP37蛋白定位在核斑中。4.棉花MTA、MTB以及FIP37蛋白之间的互作模式分析为了研究棉花GhMTA、GhMTB及GhFIP37蛋白在植物体内的作用机制,我们研究了这几个蛋白间的互作模式。酵母双杂交和双分子荧光互补结果显示,GhMTA-D能与GhMTB-A和GhFIP37-A蛋白互作,表明棉花GhMTA、GhMTB及GhFIP37蛋白可能以形成复合体的形式起作用。5.棉花MTA、MTB以及FIP37蛋白在棉花中的功能分析为了研究GhMTA、GhMTB及GhFIP37蛋白在棉花中的生物学功能,我们采用病毒诱导基因沉默(VIGS)实验手段研究其在棉花发育中的功能,结果显示:GhMTA、GhMTB以及GhFIP37的沉默会使棉花叶片的总RNA中的m6A水平降低,棉花出现叶片卷曲,顶端分生组织畸形,植株矮化等表型,说明GhMTA、GhMTB以及GhFIP37蛋白调控的m6A修饰对棉花的营养生长有重要的作用。为了研究这些蛋白在棉纤维发育中的功能,我们构建了MTB和FIP37基因的RNAi载体,进行了棉花遗传转化。获得了转基因棉花胚性愈伤组织各5个株系和转基因小苗多株,为研究棉花MTB和FIP37在棉花生长及纤维发育中的功能提供了转基因材料,相关的工作正在进行。6.拟南芥VIR基因的表达分析为了研究AtNR基因在拟南芥中的生物学功能,我们对它的表达进行了分析。qRT-PCR分析显示,AtVIR基因在拟南芥各个组织中都有表达,在第一节茎和花序中的表达较高,在莲座叶中的表达相对较低。我们也获得了AtVIRromoter-GUS转基因拟南芥植物12个株系,GUS染色结果显示At VIR基因的启动子在拟南芥的幼苗期各组织及成苗期各个组织中都具有表达活性,但在幼苗期的根和茎顶端相对较强。7.AtVIR RNAi转基因拟南芥表型分析为了研究拟南芥VIR基因的生物学功能,我们获得了 9个AtVIR-RNAi转基因阳性株系。与野生型植物相比,这些阳性AFVIR-RNAi转基因植株均出现主根根长变短,子叶和叶子变小,植株变矮的表型。8.AtVIR基因的调控研究为了研究拟南芥VIR基因的调控机理,我们采用酵母单杂交筛库实验分析AtVIR启动子的互作蛋白,结果显示拟南芥AP2/ERF类转录因子AIL6、BBM和PLT2均能与At VIR启动子互作。qRT-PCR分析显示,过量表达AtAIL6转基因拟南芥中,At VIR基因的表达量显著上调,而plt1-4plt2-2双突变体中,AtVIR基因的表达量显著下调,这暗示着该类转录因子可能正调控At VIR基因的表达。