第一部分β淀粉样蛋白31-35片段对海马CA1神经元BK通道和[Ca²⁺]_i的影响：全细胞膜片钳和离子荧光成像技术观察阿尔采末病（Alzheimer’s disease，AD）是一种不可逆的中枢神经系统的退行性疾病。主要临床表现为进行性学习、记忆和认知能力的减退；主要病理特征为新皮层、海马出现高密度老年斑（SP），神经纤维缠结（NFTs）和大量神经元的丢失等。β淀粉样蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）是构成老年斑的重要成分。Aβ由39～43个氨基酸组成，关于Aβ1-42完全肽链、Aβ25-35片段的神经毒性作用已有广泛报道。近年来的研究显示，除Aβ1-42和Aβ25-35外，一个更小的片段Aβ31-35也具有与完整肽链及Aβ25-35片段同样的神经毒性，是迄今发现的Aβ中最小的活性片段，可方便地用来分析完整Aβ分子的毒性作用机制，也可考虑作为半抗原制成抗Aβ抗体，进行AD的试验治疗。关于Aβ及其片段的神经毒作用的机制仍未彻底明了。已有研究报道，它们除了能引起Ca²⁺超载、氧化应激等毒性作用外，对细胞膜上离子通道活动的影响引起了人们的广泛兴趣。有资料表明，Aβ可抑制多种K⁺通道功能，使细胞膜复极过程延缓、动作电位时间延长，细胞兴奋性改变、放电频率增加等。大电导钙激活钾通道（BK通道）是一种重要的钾通道，广泛分布于可兴奋组织，包括中枢神经元。该通道在膜发生去极化及[Ca²⁺]_i升高的条件下被激活，开放后呈现较大的K⁺电导，在动作电位的复极过程中发挥重要作用。本研究室其他研究小组过去已进行过Aβ31-35影响BK通道的单通道分析。本研究拟采用全细胞膜片钳记录技术，在急性分离的大鼠海马CA1神经元上观察Aβ31-35对全细胞BK电流的影响；并采用Ca²⁺荧光成像技术(Ca²⁺ fluorescence imaging)，观察Aβ31-35对海马神经元的[Ca²⁺]_i的影响，以期对Aβ31-35神经毒性作用作更深入的探讨。海马神经元全细胞BK电流的特征在全细胞电压钳记录的条件下，在含Ca²⁺的浸浴液中给予细胞由-60～+45mV（以15mV递增）的阶跃去极化刺激，可记录到快速的外向电流，最大峰值可达3000pA左右（膜电位为+45mV时）。上述电流在应用TEA后几乎被完全阻断，证实该外向电流属K⁺电流。由于在浸浴液中已加入4-AP（5mM）和优降糖（5μM），分别阻断了电压依赖性K⁺通道、小电导钙激活K⁺通道和ATP敏感性K⁺通道；而根据Sun et al．（2003）对全细胞BK电流的研究，在含钙并应用了4-AP和优降糖后记录到的外向电流主要由两部分组成，即开始去极化时快速出现并很快减小的呈尖峰样的瞬变外向电流和维持较长时间不失活的持续外向电流。前者主要由BK电流构成，后者则是多种成分构成的混合电流。因此，瞬变外向电流峰值的变化可认为是BK通道开放形成的外向电流。用同样的方法在无Ca²⁺(以Mg²⁺代替)的上述灌流液中进行记录，该细胞的外向电流明显减小，再以含Ca²⁺的灌流液灌流，则记录到的外向电流幅度基本恢复，说明该外向电流是对Ca²⁺敏感的外向K⁺电流，也符合BK电流是由Ca²⁺激活的外向K⁺电流的特征。以此为基础，在以下实验中将Aβ31-35作用于上述方法记录到的外向电流中，计算瞬变外向电流峰值的变化幅度，以此来观察该肽段对BK电流的影响。Aβ31-35抑制全细胞BK电流按上述方法记录并分析Aβ31-35对BK电流的影响。结果发现，在加入了4-AP和优降糖并且含Ca²⁺的灌流液中加入5μM的Aβ31-35，记录到的瞬变外向电流的幅度减小，其最大峰值从原先的2722±201 pA降至2203±195 pA，平均下降值为19．07％±3．96％（n=8，P＜0．01）；在冲洗Aβ31-35后再进行记录，外向电流幅度基本恢复。上述结果提示，Aβ31-35可抑制全细胞BK电流。Aβ31-35和Aβ25-35升高急性分离的海马神经元[Ca²⁺]_i本实验利用Ca²⁺荧光成像技术，观察了不同浓度（5μM、12．5μM和25μM）的Aβ31-35以及Aβ25-35对急性分离的海马CA1神经元的[Ca²⁺]_i的影响。结果显示，在给予5μM的Aβ31-35时，神经元的[Ca²⁺]_i无显著改变；在给予12．5μM的Aβ31-35时，紫外激发比值R（F340／F380）由对照组的880．42±11．84升高至1002．2±47．7，升高率12．0％±3．5％（n=5，P＜0．05）；在给予25μM的Aβ31-35时，比值R由对照组的873．58±7．78升高至1311．40±112．04，升高率32．7％±5．4％（n=5，P＜0．01）；后两组的升高值之间具有显著性差异。由于Aβ25-35的毒性作用已被公认，因此我们用该肽段作为阳性对照证实Aβ31-35的钙超载作用。在给予Aβ25-35的实验中，只使用了25μM的一个剂量，观察到比值R由对照组的862．21±13．10升高至1323．20±115．13，升高率为34．1％±5．4％（n=5，P＜0．01），与相同剂量的Aβ31-35组相比，无统计性差异（P＞0．05）。以上膜片钳及胞内钙浓度测定结果显示，1)利用全细胞膜片钳记录技术结合通道阻断剂及无Ca²⁺液灌流后可记录到神经元的BK电流（瞬变外向电流）；2) Aβ31-35可通过抑制BK通道而降低BK电流；3) Aβ31-35可引起海马CA1神经元的[Ca²⁺]_i升高而引发钙超载；4)由于5μM的Aβ31-35只抑制BK电流而不影响[Ca²⁺]_i，推测Aβ31-35对海马神经元[Ca²⁺]_i及BK通道的影响可能是通过不同的途径发挥作用。第二部分Humanin对Aβ31-35抑制大鼠海马神经元BK电流及升高[Ca²⁺]_i作用的观察Humanin（HN）是新近发现的由24个氨基酸组成的线性多肽，能有效抑制由多种FAD基因突变和Aβ衍生物诱发的神经毒作用，如抑制由Aβ1-42和Aβ25-35引起的大脑皮层培养神经元死亡等。我们以往的其他实验观察证实HN可抑制Aβ31-35及Aβ25-35引起的神经凋亡，但HN发挥神经保护作用的电生理研究至今未见报道。本实验拟采用全细胞膜片钳技术记录大电导Ca²⁺激活K⁺通道（BK）电流及电压门控Ca²⁺电流，以及利用激光共聚焦技术，观察HN对Aβ31-35抑制大鼠海马神经元BK电流及升高[Ca²⁺]_i作用的影响，并对HN神经保护作用的机制进行进一步探讨。HN对Aβ31-35抑制海马C41神经元全细胞BK电流作用的影响本研究的前期工作显示，利用全细胞膜片钳记录技术，在急性分离的海马CA1神经元记录到的全细胞BK电流，可被Aβ31-35（5μM）明显地抑制。本实验拟观察HN对Aβ31-35抑制BK电流作用的影响。在全细胞电压钳记录的条件下，给予细胞由-60～+45mV（以15mV递增）的阶跃去极化刺激，在同一海马CA1神经元上，用不同的灌流液进行灌流时，分别记录代表BK电流的瞬变外向电流，比较其最大峰值的变化。步骤如下：1)以在正常的灌流液中记录的神经元BK电流作为对照；2)在灌流液中加入Aβ31-35（5μM），观察同一细胞的BK电流；3)在灌流液中同时加入Aβ31-35和HN（各5μM），记录同一细胞的BK电流。结果显示：在只含有Aβ31-35的灌流液中记录到的BK电流的最大峰值由对照的3303．67±332．7pA减少为2715．12±82．99pA，减少率为17．3％±6．8％（P＜0．005，n=5）；在此基础上加入HN进行记录时发现，记录到的BK电流最大峰值进一步减少为2225．54±254．29pA，较单独使用Aβ31-35时BK电流幅度更低，与对照组相比，减少率为32．7％±2．0％（P＜0．001），与单独使用Aβ31-35相比，减少率为18．2％±7．7％（P＜0．005）。鉴于上述出乎意料的结果，我们观察了单独应用HN对海马CA1神经元BK电流的作用。在0mV的膜电位时，BK电流的峰值从对照组的1405．97±350．87pA减少为加入HN（5μM）后的999．74±247．72pA，减少率为28．4％±10．4％（P＜0．05，n=7）。HN对海马C41神经元电压门控Ca²⁺通道的作用利用全细胞膜片钳技术，观察了HN对海马CA1神经元的电压门控Ca²⁺通道的作用。在全细胞电压钳记录的条件下，给予细胞由-60～+50 mV（以10 mV递增）的阶跃去极化刺激，可记录到快速的内向电流（浸浴液中含有TTX阻断Na⁺通道），最大峰值出现在0 mV。浸浴液中加入HN（5μM）后，Ca²⁺电流的峰值（0mV膜电位）由-622．3±118．13 pA减少为-467．4±112．28 pA，减少率为25．2％±6．9％，两者具有显著性差异（P＜0．05，n=7）。对比HN对BK电流和Ca²⁺电流的影响，发现当电压钳制在0mV时，HN对BK电流和Ca²⁺电流的抑制率很接近，分别是28．4％±10．4％和25．2％±6．9％，两者之间亦无统计学差异（P＞0．05）。HN拮抗Aβ31-35诱导的Ca²⁺内流的作用机制利用激光共聚焦技术，观察和分析了HN在培养的皮层神经元对抗Aβ所诱导的钙超载作用并进行了初步的机制分析。培养7-10天的皮层神经元分为三组。首先观察Aβ31-35（25μM）的增强Ca²⁺内流的作用；再分别观察L-型钙通道阻断剂nicardipine（20μM）和HN（20μM）对Aβ31-35升Ca²⁺作用的影响。进行Ca²⁺测定前先用荧光染料（Fluo-3）孵育细胞60min，然后用正常灌流液洗脱。实验时每组都观察25min，前5min观察未经任何处理的细胞基础Ca²⁺水平，然后各组分别给予Aβ31-35，Aβ31-35+HN和Aβ31-35+nicardipine。每个细胞前5min测得的荧光密度（F）的平均值作为基础荧光密度F_b，再将加药后所得数据都与F_b相比，用所得比值（F／F_b）来表示[Ca²⁺]_i的变化情况。结果显示：给予Aβ31-35后[Ca²⁺]_i显著增高，Aβ31-35组的F／F_b值为1．75±0．06（n=5）；而Aβ31-35+nicardipine和Aβ31-35+HN组[Ca²⁺]_i的升高值都较单独使用Aβ组有显著降低，给予nicardipine和HN处理后的F／F_b值分别为1．32±0．02（n=6，P＜0．01），1．25±0．04（n=7，P＜0．005）。说明nicardipine和HN都能抑制Aβ31-35所致的[Ca²⁺]_i升高。以上结果提示，1) Aβ31-35能引起[Ca²⁺]_i升高，Aβ可能通过L-型钙通道促进Ca²⁺内流而升高[Ca²⁺]_i；2) HN可拮抗Aβ31-35引起的Ca²⁺内流及由此形成的钙超载；3) L-型电压敏感钙通道可能是HN和Aβ共同作用的靶点。综上所述，可得出如下结论：1) Aβ具有升高[Ca²⁺]_i和抑制BK电流的作用；2) Aβ诱发的Ca²⁺超载是Aβ产生细胞毒作用的重要原因；3) HN通过抑制L-型钙通道而减弱Aβ诱发的Ca²⁺超载，可能是HN拮抗Aβ神经毒发挥保护作用的重要机制；4) L-型钙通道可能是HN和Aβ的共同靶点；5)由于观察到单独应用HN产生了对BK电流和Ca²⁺电流的抑制作用，由此推测HN对BK的作用可能是通过HN抑制Ca²⁺通道降低[Ca²⁺]_i，由此产生的对BK电流的抑制，而不是HN对BK通道的直接抑制作用。第三部分：Ⅰ型代谢型谷氨酸受体参与脊髓背角痛信号传递作用的观察近年的研究认为，兴奋性氨基酸在脊髓水平痛信号传递过程中发挥非常重要的作用。谷氨酸受体一般分为两大类：离子型受体（iGluRs）和代谢型受体（mGluRs）。过去的研究大多集中于iGluRs在脊髓水平参与伤害性信息的处理和传递过程。但在新近研究中，mGluRs在外周和中枢信息传递过程中的作用越来越受到重视。本实验用福尔马林注入引起的慢性痛模型，通过脊髓背角Fos蛋白检测与痛行为反应测定，观察了脊髓水平Ⅰ型mGluRs，包括mGluR₁和mGluR₅在脊髓痛信息处理和传递中所起的作用。实验中选取21只SD大鼠，随机分为3组，两个实验组大鼠预先鞘内分别注入mGluR₁和mGluR₅的特异拮抗剂CPCCOEt和MPEP，一个对照组只在鞘内注入等量的药物溶剂；10分钟后在三组大鼠均在一侧后脚掌注入福尔马林（5％，50μl），随即进行1h的行为国反应观察，之后立即灌注固定处死动物，用免疫组化技术检测脊髓背角Fos免疫阳性神经元（FLI）的数目。结果显示：1．鞘内分别注射CPCCOEt和MPEP后，大鼠行为痛反应的第二相较对照组均减弱约50％（每组n=7；CPCCOEt组，P＜0．05；MPEP组，P＜0．01），而第一相痛行为反应在两个鞘内给药组和对照组间无显著变化；2．分别检测三组动物福尔马林注射侧脊髓背角中的Fos免疫阳性神经元（FLI）数目，与对照组相比，CPCCOEt和MPEP注射组分别由对照组的154．9±21．4降低到101．5±21．8 （CPCCOEt组，P＜0．05）和98．3±17．0（MPEP组，P＜0．01），降幅约30％左右。上述结果表明：1．mGluR₁和mGluR₅在脊髓背角均参与痛信息的感受和传递；2．根据行为痛反应观察，mGluR₁和mGluR₅只参与福尔马林所致的第二相的痛信息的传递，即参与了慢性痛而不参与急性痛的传入；3．由于痛行为检测存在主观因素影响，它所显示的Ⅰ型mGluRs在脊髓痛传递中的参与程度可能较实际为大，免疫组化检测结果可能更接近于实际；4．mGluR₁和mGluR₅除了通过目前公认的突触后机制实现其促进脊髓痛信号的感受和传递外，也不能排除存在突触前机制，即通过传入末梢上自身受体的正反馈作用促进第一级传入末梢的递质释放，从而增强痛信号在中枢的传递。