论文一TSH与大鼠胰岛素抵抗及脂肪组织GLUT4达关系的动物实验研究　　近年来，关于促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)与肥胖、代谢综合征的相关研究成为国内外学者关注的热点。国内外多项研究发现，即使甲状腺功能在正常范围内，血清TSH水平与体重指数(body mass index，BMI)、胰岛素抵抗程度均呈显著正相关，与胰岛素敏感性指数呈显著负相关。然而，TSH引起胰岛素抵抗的具体机制尚未明确，需要进一步研究。　　脂肪组织是胰岛素的主要外周靶组织。胰岛素靶细胞的糖摄取主要是依靠葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter4，GLUT4）实现的，GLUT4特异性表达于胰岛素敏感的脂肪细胞及骨骼肌中，基础状态下大部分储存于胞内囊泡中，胰岛素刺激后可使其转位至细胞膜，同时糖转运活性增强，摄取血液中的葡萄糖以维持血糖的稳定。胰岛素抵抗与GLUT4的表达量及胞浆向胞膜的转运量减少有关，甲减或亚临床甲减人群的胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment insulinresistance index，HOMA-IR)升高，但是尚无TSH升高与GLUT4表达关系的研究报道。　　本研究拟建立亚临床甲减、临床甲减、高脂饮食肥胖大鼠模型，应用高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术及HOMA-IR指数评价大鼠胰岛素抵抗程度，并检测内脏及皮下脂肪组织GLUT4mRNA与蛋白的表达水平。探讨TSH水平升高对胰岛素抵抗和GLUT4表达的影响。　　方法:　　将48只雄性Wistar大鼠随机分成4组(n=12):完全甲减组(clinicalhypothyroidism，CH):手术完全切除甲状腺，术后一个月开始于颈背部皮下注射等体积0.9％的氯化钠溶液。亚临床甲减组(subclinical hypothyroidism，SCH):手术切除甲状腺，术后一个月开始于颈背部皮下注射L-T4溶液0.95μg/(100g·d)建立亚临床甲减模型。高脂肥胖组(HF):给予高脂饲料喂养，高脂饲料配方20％猪油、5％蔗糖、5％蛋黄粉、2％胆固醇、0.5％胆酸钠、67.5％普通饲料。正常对照组(NC):行甲状腺切除假手术，术后一个月开始于皮下注射等体积0.9％的氯化钠溶液，作为阴性对照。术后自注射药物8周后，眶后静脉采血测定甲功、血脂、空腹血胰岛素，行麻醉状态下高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验;留取附睾周围内脏脂肪组织和腹股沟皮下脂肪组织，应用Real-time PCR技术检测内脏和皮下脂肪GLUT4、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、促甲状腺激素受体(thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR)、胰岛素受体底物-1(insulin receptorsubstrate-1，IRS-1)mRNA的表达水平，应用Western blotting技术检测上述指标蛋白水平的表达。采用SPSS20.0统计学软件进行处理。　　结果:　　1.术后4周CH组与SCH组大鼠的体重均明显低于NC组与HF组(P＜0.05)。实验终点时HF组大鼠体重最重（657.2±29.7g），CH组体重最低(331.3±57.0g)，SCH组大鼠体重(445.1±42.7g)虽较CH组大鼠有明显的增加(P＜0.05)，但仍较NC组（546.7±64.2g）及HF组的体重明显降低(P＜0.05)。实验终点时眶后静脉采血测定TSH及TT4，显示TSH值CH组（17.89±5.3mIU/L）和SCH组（3.57±0.38mIU/L）较NC组（0.47±0.08 mIU/L）、HF组（0.33±0.05 mIU/L）均明显升高(P＜0.05);而CH组TT4（1.41±0.42μg/dl）较其他三组均明显降低(P＜0.05)，SCH组TT4（5.63±0.56μg/dl）与NC组（5.49±0.72μg/dl）、HF组（6.18±0.88μg/dl）无明显差异，模型制备成功。　　2.CH组、SCH组和HF组大鼠的钳夹实验60～120min的平均葡萄糖输注率（glucose infusion rate，GIR60-120）较NC组明显下降(P＜0.05)，CH组GIR60-120明显低于SCH组(P＜0.05);而此三组的HOMA-IR也比NC组的明显升高(P＜0.05)，均以HF组最明显，CH组与SCH组无明显差异。表明甲减和亚临床甲减大鼠均存在一定程度的胰岛素抵抗。　　3.GLUT4和其他相关因子在大鼠附睾周围内脏脂肪和腹股沟皮下脂肪的表达水平和变化趋势基本一致。结果显示，CH组、SCH组和HF组大鼠脂肪组织GLUT4和IRS-1 mRNA的表达均较NC组的表达明显下调(P＜0.05)，TNF-αmRNA的表达均较NC组明显上调（P＜0.05），且以HF组的下调或上调更为显著。四组之间TSHR mRNA的表达无明显差异。Western blotting检测脂肪组织蛋白表达，结果显示，CH组和SCH组大鼠脂肪组织GLUT4蛋白表达均较NC组表达下降(P＜0.05);HF组、CH组和SCH组TNF-α蛋白表达均较NC组表达升高(P＜0.05); HF组、CH组和SCH组大鼠附睾周围内脏脂肪p-IRS-1(ser307)蛋白表达较NC组明显升高(P＜0.05)，且以CH组升高最为明显;CH组大鼠皮下脂肪组织p-IRS-1(ser307)蛋白表达较NC组明显升高(P＜0.05)。　　结论:　　1.TSH水平升高并未改变大鼠脂肪组织的TSHR表达。　　2.TSH水平升高会加重大鼠胰岛素抵抗，可能部分是通过上调脂肪组织TNF-α表达、下调GLUT4表达来实现的。　　论文二TSH对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取及TNF-α达影响的实验研究　　在流行病学研究中发现，血清促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)水平升高与胰岛素抵抗显著正相关。本课题动物实验发现，甲减与亚临床甲减大鼠的胰岛素抵抗明显加重，而且胰岛素抵抗的主要外周靶组织脂肪组织中葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter4，GLUT4)表达下调、肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)表达上调，这些变化是否与体内升高的TSH水平有关系需要进一步验证。　　本研究拟培养3T3-L1脂肪细胞并进行诱导分化，应用TSH刺激分化成熟的3T3-L1脂肪细胞，观察TSH对其葡萄糖摄取和GLUT4表达的影响;同时研究TSH对细胞分泌TNF-α的影响及促进其分泌的可能信号通路。　　方法:　　诱导分化3T3-L1脂肪细胞8～10天，应用油红O染色鉴定分化程度。对分化成熟的脂肪细胞应用无血清DMEM高糖培养基过夜，给予不同浓度(0、0.1mIU/ml、1 mIU/ml、10mIU/ml)的TSH刺激48h，分别采用2-脱氧-3H-D-葡萄糖摄入法检测葡萄糖摄取量和氧化酶法葡萄糖测定试剂盒测定培养基葡萄糖消耗量;给予浓度0.1 mIU/ml TSH孵育0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h，或者给予不同浓度的TSH（0，0.01 mIU/ml，0.1 mIU/ml，1mIU/ml，10 mIU/ml）孵育细胞4h，收集细胞上清和沉淀，ELISA方法检测上清中TNF-α的浓度，Real-time PCR方法检测细胞TNF-α mRNA的表达。给予不同浓度(0、0.1 mIU/ml、1 mIU/ml、10 mIU/ml)的TSH刺激48h，检测细胞GLUT4 mRNA及蛋白水平的表达;另设一组细胞应用TNF-α拮抗剂Rapamycin(20nmol/L)预处理1h后予TSH(1 mIU/ml)刺激48h，收集细胞测定GLUT4 mRNA及蛋白水平。分组加药刺激，分别予磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3-K)抑制剂Wortmannin(10-6mol/L)干预30分钟、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，P38MAPK)抑制剂SB203580（10-5mol/L）干预30分钟、蛋白激酶A抑制剂H89(0.01mmol/L)干预15分钟，其后三组细胞予TSH(1mIU/ml)刺激48h，同时设立空白对照组和单纯TSH(1mIU/ml)干预组，Western blotting技术测定细胞TNF-α蛋白水平的表达。细胞爬片铺板，诱导分化成熟后，H89（0.01mmol/L）干预15分钟，其后予或不予TSH(1mIU/ml)刺激48h，同时设立空白对照组和单纯TSH(1mIU/ml)干预组，进行GLUT4免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜拍照比较GLUT4表达强弱。　　结果:　　3T3-L1脂肪细胞经诱导分化10天，油红O染色细胞胞浆内可见较多亮红色颗粒，证实诱导分化成功。胰岛素刺激的细胞葡萄糖摄取被认为是测定胰岛素敏感性的金标准，每分钟的衰变数(decay per minute，DPM)越高提示脂肪细胞的葡萄糖摄取量越多，有胰岛素刺激时，DPM值明显升高。随着TSH刺激浓度的增加，显示3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取量逐渐下降，差异有统计学意义（P＜0.05 vs基线）。而且，TSH会降低3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗量(P＜0.05 vs基线)，抑制效应与TSH浓度呈正相关。　　3T3-L1成熟脂肪细胞在0.1 mIU/ml TSH刺激后，细胞TNF-α mRNA的表达及培养基中TNF-α浓度明显上调，与基线水平相比差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.001)，并于刺激4h达峰值。与空白对照组相比，随着TSH浓度的增加，TNF-α mRNA的表达和培养基中TNF-α的浓度呈上升趋势，差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.001)。　　不同浓度TSH（0、0.1 mIU/ml、1 mIU/ml、10 mIU/ml）刺激3T3-L1成熟脂肪细胞48h。与空白对照组相比，随着TSH浓度的增加GLUT4 mRNA和总蛋白的表达水平明显下降(P＜0.001 vs基线);予TNF-α的拮抗剂Rapamycin预处理1h，再予TSH1 mIU/ml刺激48h后，Rapamycin可以逆转这一效应，且与空白对照组相比差异无统计学意义。　　应用三种信号通路抑制剂作用3T3-L1成熟脂肪细胞后，再予TSH刺激细胞48h，结果显示H89明显地抑制TNF-α蛋白的表达(P＜0.001)，而Wortmannin和SB203580未能够抑制3T3-L1脂肪细胞TNF-α的表达。免疫荧光结果显示，单纯应用TSH刺激后，GLUT4的荧光强度较空白对照组明显减弱;而给予H89刺激后，应用或不应用TSH刺激48h，GLUT4的荧光强度均较单纯应用TSH刺激48h的有所增强。　　结论:　　1.TSH能降低3T3-L1脂肪细胞葡萄糖的摄取量及培养基中葡萄糖的消耗量，增加脂肪细胞的胰岛素抵抗程度。　　2.TSH可以通过增加TNF-α的表达来下调GLUT4的表达，且TSH可以部分通过蛋白激酶A途径促进TNF-α的表达。　　论文三不同腰围切点值对评估中国成人代谢综合征患病率和危险因素的影响　　随着中国社会经济的快速发展，中国人的生活方式有了很大改变，导致超重与肥胖患病率的快速升高。截止到2008年底，全世界超重及肥胖症患者已达15亿，其中20％是中国人。超重和肥胖是代谢综合征(metabolic syndrome，MetS)的核心组份，而MetS是心血管疾病(cardivascular disease，CVD)和糖尿病的主要危险因素。国际糖尿病联盟(IDF)提出的MetS诊断标准强调了中心性肥胖是诊断MetS的先决条件而且可将腰围测定作为一个简单的筛查工具，同时也强调了腰围的种族差异。对亚裔成年人，除日本以外，IDF将中心性肥胖腰围切点定义为男性≥90cm，女性≥80cm。　　然而上述腰围切点并不太适用于中国成年女性，多项研究成果建议将中国成人腹型肥胖的最佳腰围切点分别设为男性≥90cm，女性≥85cm。本研究小组应用此腰围切点及中国成人血脂异常防治指南制订联合委员会(JCDCG)提出的MetS标准来进行横断面流行病学调查。研究人群来自2007～2008年中华医学会糖尿病分会组织的中国糖尿病和代谢性疾病研究。　　方法:　　由中国糖尿病和代谢性疾病研究小组应用多级分层、整群抽样方法在全国14个省、市及自治区进行了此项横断面调查研究。共有45157名20～74岁的中国居民参与调查，参与调查者需完成一份调查问卷，收集临床资料包括人口学基本特征、个人史、家族史、生活方式危险因素如吸烟和饮酒等。调查内容也包括既往高血压病、糖尿病、脂代谢紊乱和其他慢性疾病的诊断与治疗情况。按照统一标准进行体格检查，采集被调查者的身高、体重、腰围和血压;并抽取静脉血检测空腹血糖、血脂及759糖负荷后30min、120min的静脉血糖。分别应用国际糖尿病联盟(IDF)的标准和修订版IDF标准定义MetS，分析比较两种标准下不同腰围切点对MetS患病率和相关危险因素的影响。　　结果:　　经年龄标化的MetS患病率分别为24.2％(IDF)和19.5％（修订版IDF），而代谢综合征前期的患病率为8.1％。按照这两个诊断标准，代谢综合征的患病率随着年龄增加有明显的升高，且女性较男性的升高趋势更明显。　　三个不同经济水平地区的农村居民MetS患病率明显低于城镇居民(IDF标准，22.1％ vs.26.5％，P＜0.001;修订版IDF标准，17.7％ vs.21.3％，P＜0.001)。以秦岭-淮河一线为界划分中国南北地域，北方MetS患病率较南方明显升高(IDF标准，28.0％ vs.19.7％，P＜0.001;修订版IDF标准，23.1％ vs.14.7％，P＜0.001)。按性别分层，不论农村还是城镇地区，不论南方还是北方地区，女性MetS的患病率修订版IDF标准明显低于IDF标准(P＜0.001)。　　20～74岁男性中心性肥胖的患病率达到35.1％，女性中心性肥胖的患病率分别是47.5％(IDF标准)和29.7％（修订版IDF标准）;就代谢综合征单一组份而言，血压升高或者高血压的患病率是最高的，男性高达65.4％，女性达到53.0％(IDF)和58.9％（修订版IDF标准）;除女性低水平的HDL-C这一组份之外，另三项组份患病率在中心性肥胖者中IDF标准低于修订版IDF标准（P均＜0.001）。超过40％的肥胖男性和超过30％的肥胖女性有两项代谢综合征异常组份。对两种标准定义的女性中心性肥胖者中拥有两项及两项以上代谢综合征异常组份的患病率，修订版IDF标准定义的明显偏高(P＜0.05)。　　多元回归分析证实，许多危险因素包括年龄、城镇居住、较高的经济发展水平、当前吸烟、酒精摄入、糖尿病家族史、高血压家族史和肥胖家族史均与代谢综合征有明显相关性，文化水平则与代谢综合征呈负相关关系。在IDF和修订版IDF标准之间没有明显的差异。　　结论:　　按照IDF和修订版IDF标准来调查中国成人代谢综合征的患病率均是明显升高的。应用种族特异的腰围切点，男性和女性中心性肥胖的患病率均在30％左右。提示修订版IDF标准及种族特异的腰围切点(男性≥90cm，女性≥85cm)更适用于中国成人代谢综合征和中心性肥胖的诊断。