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目的：布鲁氏菌病(简称布病)是具有世界分布性的一类人畜共患传染病;全世界每年新增感染人数大约为50万人。在全世界报告有人畜疫情的国家有170多个。然而;目前的布鲁氏菌疫苗多为弱毒疫苗;存在一定的毒力。随着研究的不断深入;至今已知的布鲁氏菌蛋白中优势抗原蛋白主要包括外膜蛋白(OMPs)、核蛋白 L7/L12、表面蛋白(BCSP)、胞质结合蛋白(P39)等。P39蛋白是其中较好的T细胞抗原;是公认的布鲁氏菌优势抗原;但是其免疫保护不足。研究发现;糖基化可以提高蛋白免疫原性。本实验以期通过甘露六糖修饰P39蛋白;研究糖修饰对蛋白免疫原性的影响;为布鲁氏菌糖修饰蛋白抗原疫苗的研究提供理论基础。 方法：本实验以布鲁氏菌P39蛋白为研究对象;设计引物并利用PCR法扩增获得P39基因片段;将目的基因连接至表达载体;构建重组质粒后IPTG诱导表达重组蛋白;利用GST层析柱对目的蛋白P39进行纯化。EDC/NHS化学偶联法对该蛋白进行甘露六糖修饰;并检测其糖与蛋白修饰比。然后利用MTT法、间接ELISA法对甘露六糖修饰蛋白免疫小鼠后进行细胞增殖、细胞因子检测、抗体水平检测等实验。此外;利用上述方法研究该糖修饰蛋白对树突状细胞和巨噬细胞的作用情况。FITC 标记甘露六糖修饰蛋白探究巨噬细胞吞噬蛋白情况。最后Western Blot检测细胞表面受体TLR2、TLR4、MyD88以及TRAF6表达情况。 结果：本实验采取PCR方法从布鲁氏菌16M菌株中扩增目的基因片段1206 bp;并将此片段成功连接至pGEX-6P-1表达载体;阳性菌株经IPTG诱导;P39基因在原核表达系统中以可溶形式成功表达。通过对诱导剂浓度和诱导温度的筛选;28℃条件下IPTG终浓度为1 mmol/L时;P39蛋白表达量最大。通过GST亲和层析柱法对目的蛋白进行纯化;目的蛋白大小为45 kDa;与理论预测值相符;且成功纯化得到了该蛋白的单一组分。 对目的蛋白P39进行糖基化修饰反应;根据测定结果计算得出糖与蛋白的实际反映比值为2.3:1。甘露六糖修饰蛋白分子被巨噬细胞RAW 264.7吞噬的速度较快。在蛋白作用6h时;其被吞噬数量高于未修饰蛋白组。甘露六糖修饰的目的蛋白能显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖。此外;该蛋白刺激巨噬细胞和树突状细胞时;细胞增殖状况亦显著增强。 甘露六糖修饰目的蛋白在第五周检测到较高的抗体浓度;且高于未修饰蛋白刺激小鼠产生的抗体浓度。经甘露六糖修饰P39蛋白刺激小鼠后;小鼠脾细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4以及IL-10的含量与未修饰蛋白相比均显著增加。在甘露六糖修饰的蛋白刺激树突状细胞后可检测到较高的IL-10;且差异显著。甘露六糖修饰的P39蛋白能够提高细胞内TLR2受体表达。 结论：甘露六糖修饰的P39蛋白不仅能够促进淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞增殖;其也能够使机体的细胞免疫和体液免疫水平显著提高;而其发挥免疫作用可能是通过TLR2受体途径。