【摘 要】
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带小棒链霉菌（S.clavuligerus）的cefD基因编码异青霉素异构酶,其基因的GC含量高达74﹪.通过引物设计、退火温度、有机辅剂及DNA聚合酶等方面改进传统PCR法的反应体系和扩增条件,
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带小棒链霉菌（S.clavuligerus）的cefD基因编码异青霉素异构酶,其基因的GC含量高达74﹪.通过引物设计、退火温度、有机辅剂及DNA聚合酶等方面改进传统PCR法的反应体系和扩增条件,摸索得到适用于高GC含量链霉菌基因组扩增的PCR法.在此条件下分别扩增链霉菌cefD基因的上、下游阅读框架及侧翼序列,体外拼接,得到cefD全基因.随后研究了链霉菌cefD基因在大肠杆菌与链霉菌中的表达.将cefD基因分别置于大肠杆菌启动子Ptrc、Plac、T7下,构建表达质粒pZHH1/pZHH2、pJJ3/pJJ4、pJJ7/pJJ8,在相应的大肠杆菌宿主JM105、JM83和BL21（DE3）中表达,但是没有明显的蛋白表达条带.而将cefD基因置于链霉菌启动子PermE下,构建表达质粒pJJA,在Slividans中得到低水平表达.另一方面对培养基组成、菌龄、原生质体制备条件（溶菌酶浓度及溶菌酶处理时间）及再生培养基组成等方面进行优化,建立S.clavuligerus再生系统.利用优化的再生系统制备的原生质体再生率明显提高,达到7﹪,为进一步建立S.clavuligerus转化系统奠定了基础.
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