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植物激素水杨酸(salicylic acid,SA)与植物抗病性密切相关。研究表明WRKY转录因子在植物的生长发育和抗性方面起到重要的作用,且主要通过SA途径参与生物胁迫。然而,WRKY转录因子是如何通过调控SA来参与苹果的抗性,特别是对轮纹病抗性的分子机制尚不明确。本文通过鉴定苹果水杨酸合成途径中的关键酶异分支酸合成酶MdICS1和酰基腺苷酶MdPBS3.1,确定了两个WRKY转录因子MdWRKY15和MdWRKY46,它们分别调控MdICS1和MdPBS3.1基因的表达进而提高苹果对轮纹病菌的抗性。此外,SA不仅影响MdWRKY15和MdWRKY46基因的表达,而且诱导MdWRKY31基因的表达。进一步研究发现,MdWRKY31通过与MdHIR4互作增强苹果对轮纹病菌的抗性。本文主要研究结果如下: 1.发现MdWRKY15通过激活MdICS1的表达提高苹果对轮纹病菌的抗性。一定浓度的SA处理能增强苹果对轮纹病菌的抗性,且轮纹病菌侵染提高了病斑临近部位的抗氧化物酶活性,如过氧化氢酶(catalase,CAT)、过氧化物酶(peroxidase,POD)以及超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)等。SA合成关键酶基因MdICS1的表达受到轮纹病菌的诱导,其过量表达增加了自由态水杨酸(free salicylic acid)的积累,同时影响病原相关基因MdPR1、MdPR5和MdNPR1的表达水平,增强苹果对轮纹病菌的抗性。MdICS1启动子的序列分析表明,顺式作用元件W-box对苹果响应轮纹病菌至关重要,以此为诱饵进行酵母单杂交筛选,筛选到了MdICS1启动子W-box元件的潜在结合蛋白WRKY转录因子MdWRKY15,二者的特异性结合通过凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)、酵母单杂交(yeast one-hybrid,Y1H)、染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation polymerase chain reaction,ChIP-PCR)进一步证实。随后,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantification polymerase chain reaction,qRT-PCR)、荧光素酶分析(luciferase analysis,LUC)和β-葡萄糖苷酶(β-Galactosidase,GUS)分析表明,MdWRKY15能够在转录水平激活MdICS1基因的表达。最后,遗传转化研究表明,MdWRKY15在抵御轮纹病中的作用至少部分依赖于MdICS1。综上所述,MdWRKY15通过直接结合MdICS1启动子的W-box元件,激活MdICS1的基因转录,提高SA的积累水平,进而上调抗性相关基因的表达,增强苹果对轮纹病菌的抗性。 2.揭示MdWRKY46通过激活MdPBS3.1的表达提高苹果对轮纹病菌的抗性。研究发现,苹果轮纹病菌能诱导MdPBS3.1的表达,且MdPBS3.1过量表达能增加自由态水杨酸(free salicylic acid)和结合态水杨酸葡萄糖苷(SA-O-?-glucoside,SAG)的含量。SA的积累能促进病原相关基因MdPR1、MdPR5和MdNPR1的表达,提高苹果对轮纹病菌的抗性。酵母单杂交筛库结果表明,MdWRKY46可能结合MdPBS3.1基因的启动子,EMSA、Y1H、ChIP-PCR的试验结果进一步证实,MdWRKY46可以直接与MdPBS3.1启动子的W-box元件结合。GUS和LUC分析进一步表明,MdWRKY46可以激活MdPBS3.1基因的表达。利用苹果愈伤组织和果实进行稳定和瞬时遗传转化,并鉴定转化材料对苹果轮纹病菌的抗性,结果表明,MdWRKY46通过转录激活MdPBS3.1基因表达提高了苹果对轮纹病菌的抗性。 3.苹果MdWRKY31通过与MdHIR4相互作用增强苹果对轮纹病菌抗性。研究发现,水杨酸能诱导MdWRKY31基因的表达,且在拟南芥和烟草中异位表达MdWRKY31显著提高了转基因植株的抗性。进化树分析显示,MdWRKY31属于WRKY转录因子的IIb组,含有一个典型的WRKY结构域;亚细胞定位显示,MdWRKY31定位于细胞核。进一步探究发现,MdWRKY31过表达提高了苹果愈伤组织和果实对轮纹病菌的抗性,接种轮纹病菌后,转基因愈伤组织中抗性基因的表达水平和CAT、POD以及T-SOD的酶活性均高于对照。酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)、Pull-down和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)实验证明,MdWRKY31与MdHIR4蛋白相互作用,而MdHIR4是苹果轮纹病菌抗性的负调控因子;本研究发现,MdWRKY31与MdHIR4互作能够抑制MdHIR4的功能,进而提高苹果的轮纹病抗性。此外,MdWRKY31还能直接结合MdHIR4基因的启动子,并抑制其表达。总之,MdWRKY31通过抑制MdHIR4的表达和功能调控苹果对轮纹病菌的抗性反应。