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主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC),是由一群紧密连锁并且具有高度多态性的一组基因群家族,它们均定位于染色体的特定区域上；其编码的基因表达于不同的细胞表面,在细胞的免疫应答过程中参与抗原的递呈。MHC Ⅰ类基因和MHC Ⅱ类基因两个亚族是MHC分子的主要基因家族,在内质网中,MHC Ⅲ类分子的α、β链与自身聚合的γ链三聚体再进行聚合,形成特殊的九聚体(αβγ)3结构。二十世纪七十年代末,Jones等相关在研究I-A、I-E分子时发现,其中γ链不同于α、β链的多态性,呈非多态性,此现象在所有的品系的小鼠中均存在,故而将Y链定义为恒定链(Invariant chain, Ii)。Ii是MHCⅡ分子重要的伴侣蛋白分子,其白细胞分化抗原编号为CD74,在MHCⅡ分子的正确折叠、组装及其蛋白的表达和抗原呈递中起重要的作用,随着研究的深入,Ii的结构、抗原呈递的机理逐渐被人们所认知。Ii由胞浆区、跨膜区和内质网区3个结构域组成,它的主要功能是协助MHCⅡ类分子递呈外源性抗原肽。其81-216位的内质网腔区含有CLIP (Class Ⅱ-associated invariant chain peptide,81-104 aa)和三聚体区(TRIM, Trimerization)两个主要片段。研究表明,在Ii的CLIP存在与MHCⅡ类分子的结合位点(CBS, Class Ⅱ binding site)片段。CBS片段又分为两个功能片段,即与所有多态性MHCⅡ结构相关的混合结合位点(PBS,promiscuous binding site,81-87 aa)片段和沟槽结合位点(GBS, groove binding site,91-99aa)片段。当Ii的CLIP与MHCⅡ类分子结合时,PBS存在于MHCⅡ类分子的肽结合沟槽外部,同CLIP与MHCⅡ类分子的解离有关,而GBS与MHCⅡ类分子的肽结合沟槽相互作用。首先,通过对Ii的序列分析后,将其划分为胞浆区、跨膜区、CLIP区、三聚体区,其中CLIP区又划分为PBS、GBS两个区,分段设计引物,同时用实验室前期筛选的新城疫病毒NDVF蛋白的优势抗原表位F2,通过重叠延伸PCR技术,克隆构建出含有F2抗原表位和不同Ii片段的嵌合体,将其插入pET-32a载体中,并将单独的F2抗原表位插入pGEX-4T-1载体中。通过PCR以及测序结果表明,所构建的多组重组质粒中均含预期片段。其次,对用于小量诱导表达构建的8个重组质粒,进行了诱导时间、IPTG浓度、诱导温度等多方面原核表达条件的优化,以最佳条件进行大量表达。实验中通过SDS-PAGE电泳检测,8个重组质粒均能在大肠杆菌Rosetta(DE3)中正确表达,分子量分别为GST/F2:29.9 kDa、His/F2:23.9 kDa、His/Cyt/TM/F2:32.8 kDa、 His/Cyt/TM/F2/GBS:34.7 kDa、His/Cyt/TM/PBS/F2:34.4 kDa、His/Cyt/TM/F2/TRIM: 45.1 kDa、His/Cyt/TM/F2/GBS/TRIM:46.9 kDa和His/Cyt/TM/PBS/F2/TRIM:46.7kDa,与理论预期结果相符。我们将大量表达所得到的菌液进行洗涤离心、反复冻融以及超声波破碎处理后,SDS-PAGE电泳检测其表达形式,再通过Native-PAGE(非变性非还原性PAGE)和0.25 mol/L KCl切胶纯化法进行纯化蛋白,得到浓度和纯度均满足实验所需。最后,用前期所得到的融合蛋白免疫6周龄的SPF级昆明系雌性小鼠。32只小鼠分8个组,期中7个组为实验组,1个组空白对照组,每组4只。三次免疫间隔周期分别为10天和7天,第三次免疫后7天,经眼球采血,分离收集血清抗体。再通过间接ELISA法摸索最佳实验条件,条件成熟后检测不同的实验组的抗体效价。结果表明,一是所构建的含不同Ii功能片段/F2嵌合体的6个免疫组,均比单独F2的免疫组提高抗体水平1.5-4.9倍；二是在上述6个免疫组中,含CLIP的PBS或GBS的免疫组比不含CLIP的免疫组增强1.6-2.4倍；三是含PBS比含GBS的免疫增强作用高1.5倍。由此,我们得到结论,Ii胞浆区、跨膜区具有增强免疫效果的作用,而CLIP的PBS在Ii免疫载体中的作用优于GBS。综上所述,本实验成功克隆了基于小鼠Ii的CLIP区两个片段和NDV F蛋白F2优势抗原表位的基因片段,分别插入原核表达质粒pGEX-4T-1、pET-32a中,经过大肠杆菌表达成功后纯化得到目的蛋白,免疫小鼠,检测抗体效价,分析不同实验组的效价水平。结果表明,Ii的活性片段Cyt/TM和CLIP均具有增强体液免疫的功能,其中,CLIP区两个片段增强作用有差异。这些为新型的恒定链活性片段载体疫苗的临床应用奠定了基础。