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目的:本实验分别研究二甲双胍(Metformin,Met)、辛伐他汀(Simvastatin,Sim)及两者联合在体外对三阴性高侵袭性乳腺癌MDA-MB-231细胞中NF-κB活性的影响,分别检测单药及联合用药干预后MDA-MB-231细胞的活性及增值的变化,并进一步探讨可能发生的作用机制。客观评价二甲双胍、辛伐他汀及两者联合是否能够成为TNBC个体化及综合性治疗的辅助用药,针对NF-κ B信号通路的靶向治疗能否使乳腺癌的综合性治疗更加完善,最终为预防、治疗及预后提高TNBC的临床治疗有效率提供新的治疗观点。 方法:在体外培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞,应用不同浓度的Met(0、0.1、0.5、2.5、12、5mmol/l)、不同浓度的Sim(0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0μ mol/l)及两药联合进行干预24h、48h,用MTT比色法观察其对该细胞增殖的影响,并进一步探讨单药及两药联合分别抑制MDA-MB-231细胞的增殖与NF-κ B活性受抑制之间的依赖关系。检测对照组及各实验组MDA-MB-231细胞活性、细胞周期的变化。蛋白印迹法(Westernblot)分别检测实验组NF-κB、CCND1的变化,为进一步探讨MDA-MB-231细胞NF-κB的激活受抑制提供科学依据。 结果和结论: 1.二甲双胍对MDA-MB-231细胞生物活性的影响 MTT分析结果显示,经不同浓度的二甲双胍作用与MDA-MB-231细胞24h后,与溶剂对照组相比,对MDA-MB-231细胞增殖活性有明显的抑制作用(**P=0.02),作用效果呈药物浓度依赖性。不同浓度二甲双胍作用与MDA-MB-231细胞24h后,平均OD值逐渐降低。 2.辛伐他汀对MDA-MB-231细胞生物活性的影响 MTT分析结果显示,经不同浓度的辛伐他汀作用于MDA-MB-231细胞24h后,与溶剂对照组相比,对MDA-MB-231细胞增殖活性有明显的抑制作用(*P=0.01),作用效果呈药物浓度依赖性。不同浓度辛伐他汀作用与MDA-MB-231细胞24h后,平均OD值逐渐降低。 3.二甲双胍联合辛伐他汀对MDA-MB-231细胞生物活性的影响 MTT分析结果显示,经不同浓度二甲双胍联合辛伐他汀作用于MDA-MB-231细胞24h后,与溶剂对照组、单药相比,对MDA-MB-231细胞增殖活性有非常明显的抑制作用(***P=0.002),作用效果呈药物浓度依赖性。 4.二甲双胍、辛伐他汀及二甲双胍联合辛伐他汀对MDA-MB-231细胞凋亡的影响二甲双胍、辛伐他汀及二甲双胍联合辛伐他汀分别可以诱导MDA-MB-231细胞凋亡,使部分细胞出现皱缩,连接松解,胞浆致密,细胞器退变,形态不规则、细胞核固缩、空泡样变性、核碎裂等凋亡的形态学变化。给予二甲双胍、辛伐他汀及二甲双胍联合辛伐他汀抑制细胞活性的最适浓度可以清晰的看到凋亡细胞的比例也在逐渐增加,凋亡细胞有显著差异。 5.二甲双胍联合辛伐他汀对MDA-MB-231细胞周期分布的影响 给予二甲双胍、辛伐他汀及二甲双胍联合辛伐他汀抑制细胞活性的最大浓度,可以清晰的看到MDA-MB-231细胞DNA合成的S期细胞比例下降(P<0.05),而相对静止阶段的G0/G1期细胞比例却明显上升(P=0.02)。提示二甲双胍、辛伐他汀及二甲双胍联合辛伐他汀可抑制MDA-MB-231细胞由G0/G1期向S期的转化,且提示我们细胞的增殖率逐渐下降。 6.Western blot检测结果 取对数生长期细胞,提取细胞总蛋白,Western blot检测细胞中NF-κB、CyclinD1表达的变化,结果显示在没有经过药物处理的空白对照组,NF-κB、CyclinD1蛋白表达在最高,明显高于二甲双胍、辛伐他汀单药组及联合用药组,差异具有统计学意义(P<0.05),且二甲双胍组、辛伐他汀组中NF-κB、CyclinD1的表达高于二甲双胍联合辛伐他汀组,差异具有统计学意义(P<0.05),但是二甲双胍组与辛伐他汀组两者之间NF-κB、CyclinD1的表达没有统计学差异。