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研究背景:感染后咳嗽和难治性慢性咳嗽经常以上呼吸道病毒感染作为发病的启动因素。已有研究发现呼吸道病毒感染后肺组织局部会聚集更高比例IFN-γ阳性的效应T淋巴细胞,并在肺部释放高浓度的IFN-γ。我们前期研究发现IFN-γ不仅增加了咳嗽敏感性,还直接引起了咳嗽相关的动作电位。我们还发现与正常对照人群比较,CHS患者诱导痰中IFN-γ+CD8+T淋巴细胞与IFN-γ+CD4+Th1淋巴细胞数量明显增多,痰上清中IFN-γ含量增多。因而,呼吸道病毒感染可能通过肺部T淋巴细胞释放的IFN-γ导致感染后咳嗽与难治性慢性咳嗽。然而,急性病毒感染后,机体感染部位T淋巴细胞一般会经历一个从扩增到凋亡的过程。在病毒早已被机体清除的情况下,释放IFN-γ的T淋巴细胞为何能较长时间存在尚不得知。干扰素-γ-诱导蛋白-10(IP-10)是与CXCR3结合的趋化因子配体中的一员,CXCR3在许多不同表型的淋巴细胞上表达(包括CD4+T和CD8+T淋巴细胞)。在体外水平与体内水平研究中,IFN-γ可与气道上皮细胞、巨噬细胞、内皮细胞等多种类型细胞的IFNGR结合、激活JAK/STAT1信号通路,刺激这些细胞分泌IP-10等炎症趋化因子。此外,IP-10能够募集活化的CXCR3+IFN-γ+T淋巴细胞与CXCR3+IFN-γ+CD8+T淋巴细胞到吸烟的COPD患者气道,导致肺部炎症损伤。IP-10/CXCR3通路还有助于小鼠同种异体干细胞移植后,向小鼠肺部募集分泌IFN-γ的T淋巴细胞。T淋巴细胞内CXCR3介导的ERK信号通路能够增加T淋巴细胞迁移速率,其在IP-10诱导的T淋巴细胞迁移过程中发挥了关键作用。T淋巴细胞内ERK信号通路与纤维状肌动蛋白(F-actin)的聚合均参与了T淋巴细胞迁移到外周炎症部位的过程。据此,我们提出假设,肺部IFN-γ通过促进分泌IFN-γ的T淋巴细胞增加,导致淋巴细胞炎症和咳嗽敏感性增加。JAK/STAT1信号传导通路、IP-10/CXCR3轴、ERK通路和F-actin聚合可能参与其中。研究目的:探讨肺部IFN-γ对分泌IFN-γ的T淋巴细胞和咳嗽敏感性的影响,并确定JAK/STAT1信号传导通路、IP-10/CXCR3轴、ERK通路和F-actin聚合参与其中的潜在机制。研究方法:1、在实验一中,我们将C57BL/6小鼠分为对照组、三个梯度剂量的IFN-γ模型组(3.125、12.5和50μg/kg IFN-γ)。对照组和模型组分别给予50μl PBS或重组小鼠源IFN-γ滴鼻入肺,每天一次,连续5天。第7天称重后,留取标本,进行外周血和BALF细胞总数计数和分类计数,肺组织病理炎症形态学观察,ELISA法检测肺BALF和组织匀浆的IFN-γ、IP-10及其他细胞因子的含量,尿酸试剂盒和BCA蛋白试剂盒检测BALF上清尿酸含量和总蛋白含量,Western Blot和免疫荧光法检测肺组织P-Jak1、P-Stat1、P-Erk1/2的表达、流式细胞术检测外周血单个核细胞(PBMC)和肺驻留单个核细胞(LRMC)中IFN-γ+T及各种类型T淋巴细胞比例及F-actin的含量。2、在实验二中,根据实验一结果和查阅相关文献,确定合适的IFN-γ及信号通路抑制剂浓度。我们将C57BL/6小鼠分为对照组、IFN-γ模型组、IFN-γ+JAK1抑制剂组、IFN-γ+STAT1抑制剂组、IFN-γ+CXCR3抑制剂组、IFN-γ+F-Actin聚合抑制剂组和IFN-γ+ERK1/2抑制剂组。对照组给予50μl PBS滴鼻,模型组和抑制剂组给予50μl小鼠源IFN-γ滴鼻(50μg/kg),每天一次,连续5天。在每天滴鼻5分钟后,抑制剂组小鼠腹腔注射相应抑制剂,而对照组和IFN-γ模型组小鼠腹腔注射同样体积的载体溶液。第7天称重后,留取标本,进行相关指标检测,检测指标同实验一。3、在实验三中,我们将Hartly豚鼠分为对照组和IFN-γ模型组。IFN-γ模型组经喉镜气管内滴注200μl重组豚鼠源IFN-γ(12.5μg/kg),对照组则给予相同体积的PBS,每天一次,连续7天。在最后一次气管内滴注两天后,检测豚鼠咳嗽敏感性的变化。结果:1、IFN-γ滴鼻入肺可引起小鼠肺部和外周血中分泌IFN-γ的T淋巴细胞的比例增高;并可引起小鼠肺部IFN-γ水平病理生理性增高,气道上皮受损和肺血管通透性增高。2、IFN-γ气管内滴注入肺可引起豚鼠咳嗽敏感性增高。IFN-γ可激活肺泡上皮细胞中的Stat1通路,可引起IP-10的释放,及引起肺驻留淋巴细胞中ERK的激活和F-actin的聚集。3、CXCR3抑制剂明显地抑制了IFN-γ诱导的所有炎症改变。Stat1抑制剂通过抑制T淋巴细胞增殖,减轻了分泌IFN-γ的T淋巴细胞的浸润。F-actin聚合和ERK1/2通路也参与了肺部IFN-γ诱导的肺血管通透性增加和外周血中分泌IFN-γ的T淋巴细胞的增多。结论:肺部IFN-γ水平病理生理性过高,可能通过IP-10/CXCR3轴导致分泌IFN-γ的T淋巴细胞数量的增加,从而引起肺淋巴细胞炎症和咳嗽敏感性增高。